線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
MCA是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個中間產(chǎn)物,，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強度的主要指標之一,。
配合測定丙酮酸含量,、丙酮酸脫氫酶活性,、乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量,，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進行程度,，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰CoA情況,，（3）乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進行狀況,。
測定原理：
MCA在檸檬酸裂解酶的作用下,，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下,，α-酮酸進一步與苯肼反應(yīng),，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰,，該波長下吸光度的變化程度可反映出MCA的含量,。
自備儀器和用品：
分光光度計/酶標儀、水浴鍋,、可調(diào)式移液槍,、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽,、蒸餾水,。
試劑組成和配制：
酸性提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,。
堿性提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存。
試劑一：液體6mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑二：液體2mL×1瓶，4℃保存,。
試劑三：粉劑×1瓶,，4℃保存；臨用前加入6mL蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑4℃保存,；
標準液：液體1mL×1支，10μmol/mL檸檬酸標準液,，4℃保存,。
線粒體中檸檬酸提取：
稱0.05~0.1g樣品（建議稱0.1g樣本），加入0.5mL酸性提取液,，冰上充分研磨,，600g/min 4℃離心5min,；取上清至另一EP管中，11000g/min 4℃離心10min,，棄上清（取300μL該上清液和300μL堿性提取液中和后可用于細胞質(zhì)CA含量測定）,；沉淀即線粒體，向沉淀中加入0.5mL酸性提取液,，充分懸浮溶解,，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒,，間隔10秒,，重復(fù)30次），取此溶液300μL和300μL堿性提取液中和,，混勻,，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）。
測定步驟：
1,、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長到330nm，蒸餾水調(diào)零,。
2,、試劑一、二和三37℃預(yù)熱10min,。
3,、樣本測定：
空白管和標準管只需要各做一個。
試劑名稱(μL) | 空白管 | 標準管 | 測定管 |
試劑一 | 60 | 60 | 60 |
蒸餾水 | 60 | ||
標準液 | 60 | ||
樣本 | 60 | ||
試劑二 | 20 | 20 | 20 |
試劑三 | 60 | 60 | 60 |
充分混勻,，330nm立即測定初始吸光值A1和37℃孵育30min后的吸光值A2,，ΔA=A2 –A1。
檸檬酸含量計算：
（1）按蛋白濃度計算
檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C標準管×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標準管－ΔA空白管) ×V樣]÷（V樣÷Cpr）=10×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標準管－ΔA空白管)÷Cpr
蛋白質(zhì)含量需要另外測定,。
（2）按樣本鮮重計算
檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標準管×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標準管－ΔA空白管) ×V樣]÷（W×V樣÷V樣總）=10×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標準管－ΔA空白管)÷W
C標準管：標準液濃度,，10μmol/mL； V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.06mL,；V樣總：加入提取液體積：1mL,；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g。
注意：Z低檢測限為10nmol/mg prot或1μmol/g鮮重,。
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