線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一,，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反,，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸,。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑,。因此,，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝,、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng),、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH,，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中,，NAD-MDH分布于細胞質(zhì)和線粒體中,。
測定原理：
MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸,，導致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水,。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存,；
試劑二：20mL×1瓶,，-20℃保存；
試劑三：1.5mL×1支,，-20℃保存,；
試劑四、液體20 mL×1瓶,，在4℃保存,；
試劑五、粉劑×1瓶,，-20℃保存,；
樣本測定的準備：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1,、 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。
2,、 將勻漿液于600g，4℃離心5min,。
3,、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心10min,。
4,、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的MDH（此步可選做）,。
5,、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3秒,，間隔10秒，重復30次）,，用于MDHm活性測定,。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。
2,、檢測工作液的配制：用時在試劑五中加入19mL試劑四和0.5mL蒸餾水,，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融,。
3、測定前將檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,。
4,、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液，混勻后立即記錄340nm處20s時的吸
光值A1和 1min20s后的吸光值A2,，計算ΔA=A1-A2,。
MDHm活力單位的計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
MDHm（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =1299×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
MDHm（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=0.65×ΔA
V反總：反應體系總體積，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.005 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202mL；T：反應時間,，1 min,；W：樣本質(zhì)量，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；2000：細胞或細菌總數(shù)，2000萬,。
b.用96孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
MDHm（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =2598×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
MDHm（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=1.3×ΔA
V反總：反應體系總體積,，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑，0.5cm,；V樣：加入樣本體積,，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應時間，1 min,；W：樣本質(zhì)量,，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；2000：細胞或細菌總數(shù)，2000萬,。
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