蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,，裂解葡萄糖苷鍵,，催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到果糖、木糖,、半乳糖和鼠李糖等,，合成相應(yīng)的葡萄糖基低聚糖。此外,，SP還能催化氫醌合成熊果苷,，具有很強(qiáng)的美白效果，在化妝品工業(yè)中具有重要應(yīng)用,。
測定原理：
SP能夠以磷酸為受體,，催化蔗糖產(chǎn)生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖,，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH,，導(dǎo)致340nm光吸收值增加。測定340nm吸光度增加速率,，即可計(jì)算SP活性,。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、低溫離心機(jī),、恒溫水浴鍋,、酶標(biāo)儀、96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存,。
試劑二：粉劑×1支,，-20℃避光保存，臨用前加2.5mL蒸餾水溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1支,，-20℃避光保存,，臨用前加5mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿,，然后10000g，4℃,，離心10min,，取上清待測。
2. 細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時間3min）；然后10000g,，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測,。
測定操作表：
1.酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至340nm,。
2.操作表
試劑名稱 | 對照管 | 測定管 |
試劑一（μL） | 120 | 120 |
試劑二（μL） | 20 | 20 |
試劑三（μL） | 40 | 40 |
樣本（μL） | 20 | |
蒸餾水（μL） | 20 | |
迅速混勻,，于96孔板，37℃下測定340nm的初始吸光值與反應(yīng)2min后的吸光值,，測定管記作A1與A2,，對照管記作A3與A4，△A=（A2- A1）-（A4- A3）。 | ||
SP活性計(jì)算公式：
1. 按照蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：37℃,，pH6.8時,，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（nmol/min/mg prot）=
×V反總÷V樣÷Cpr÷T=1608×△A÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：37℃,，pH6.8時,，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（nmol/min/g 鮮重）=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1608×△A÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：37℃,，pH6.8時,，每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（nmol/min/104 cell）=×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個）)÷T=1608×△A÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）
：NADPH摩爾消光系數(shù),，6220 L/mol/cm,；d：比色皿光徑，0.5cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積,，0.02mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；Cpr：蛋白濃度,，mg/mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；T：反應(yīng)時間，2min
注意事項(xiàng)：
1. 可選用BCA法測定蛋白含量試劑盒測定蛋白含量,。
2. 樣本較多時,，可以按照每個樣本試劑一：試劑二：試劑三=120：20：40（μL）的比例配制工作液，用多少配多少,，臨用前立刻配制,，10分鐘內(nèi)使用。
提供商 |
優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
8次 |
資料大小 |
129.5KB | 資料類型 |
WORD 文檔 |
資料圖片 |
點(diǎn)擊查看 | 瀏覽次數(shù) |
410次 |
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
4
立即詢價(jià)
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)