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細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（cell-wall binding acid invertase, B-AI）試劑盒說明書

                                          微量法100管/48樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase,，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一,。根據(jù)最適 pH,，Ivr分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩種類型。                           

AI的最適pH為3～5,。AI分為可溶性AI(S-AI)和細(xì)胞壁不溶性AI（B-AI）兩種類型,。B-AI存在于細(xì)胞間隙并結(jié)合在細(xì)胞壁上,，主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時蔗糖的分解,，以維持庫源之間蔗糖的濃度。

測定原理：

B-AI催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖,，進(jìn)一步與3,5－二硝基水楊酸反應(yīng),，生成棕紅色氨基化合物，在510nm有特征光吸收,，在一定范圍內(nèi)510nm光吸收增加速率與B-AI活性成正比,。

自備用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液1：液體100mL×1瓶,，4℃保存;

提取液2：液體100mL×1瓶,，4℃保存;

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存;

試劑二：粉劑×1瓶,，4℃保存,；臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存;

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存,；

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液1體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液1）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。12000g 4℃離心10min，棄上清,，沉淀中加入1mL蒸餾水,，充分震蕩混勻，12000g 4℃離心10min,，棄上清,，沉淀中加入1mL提取液2 充分混勻，4℃浸提過夜,，12000g 4℃離心20min,，取上清置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

1,、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至510nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻,， 37℃準(zhǔn)確水浴30min后,，95℃水浴10min（蓋緊，以防水分散失）,，流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

混勻,，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失）,，流水冷卻后充分混勻,，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm處記錄各管吸光值A,，如果吸光值大于2,，可以用蒸餾水稀釋后測定(計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù))，ΔA=A測定-A對照,。每個測定管設(shè)一個對照管,。

B-AI活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）,，y為吸光值,。

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位,。

B-AI活性（μg /min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計(jì)算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI活性（μg /min /g鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.05mL,；V2：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本鮮重，g,。

b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值,。

（1）按蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位,。

B-AI活性（μg /min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計(jì)算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI活性（μg /min /g鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.05mL,；V2：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本鮮重，g,。

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