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磷脂酶A2（phospholipase A2,，PLA2）試劑盒說明書

微量法100T/48S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂酰基水解酶,，廣泛存在于動植物組織,、細菌,、細胞核分泌物中，參與脂肪消化,，精子成熟,、細胞信號傳遞、脂質(zhì)過氧化修復(fù),、宿主反應(yīng)等生理過程,，在控制體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機體新陳代謝,、參與疾病的病理進程等方面發(fā)揮著及其重要的作用,。

測定原理：

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產(chǎn)生游離巰基，與DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì),，在412nm處有特征吸收峰,。

自備實驗用品及儀器：

天平、超速冷凍離心機,、研缽,、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存。

試劑一：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存,。

試劑三：液體×5瓶,，-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入1.8mL試劑二充分混勻,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

樣品處理：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g,，加入1mL提取液）加入提取液,，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min,，取全部上清于4℃,、100000g離心30min，棄上清,，取沉淀溶于1mL試劑一,。

2.        細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時間3min）；然后于4℃,，10000g離心5min,，取全部上清于4℃、100000g離心30min,，棄上清,，取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清：直接測定,。

測定操作：

計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 73.53×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位,。

PLA2活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（×d）×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 73.53×△A÷W

3. 細胞數(shù)量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位,。

PLA2活性（nmol/min/10⁴ cell）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T= 73.53×△A÷細胞數(shù)量

4按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mL）= △A÷（×d）×V反總÷V樣÷T= 73.53×△A

：TNB消光系數(shù),，13600L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V反總：反應(yīng)總體積,，1mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積,，0.1mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；

T：反應(yīng)時間,，10min

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1．按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位,。

PLA2活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=147.06×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（×d）×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 147.06×△A÷W

3. 細胞數(shù)量計算

酶活性定義：每10⁴個細胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位,。

PLA2活性（nmol/min/10⁴ cell）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T=147.06×△A÷細胞數(shù)量

4按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個酶活力單位,。

PLA2活性（nmol/min/mL）= △A÷（×d）×V反總÷V樣÷T= 147.06×△A

：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑,，0.5cm,；V反總：反應(yīng)總體積，1mL,；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積,，0.1mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；

T：反應(yīng)時間,，10min

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