丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
PDC主要存在于酵母中,，是乙醇發(fā)酵的關鍵酶之一,，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。
測定原理：
PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+,；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD+沒有,；通過測定340 nm光吸收下降速率,，來計算PDC活性。
自備儀器和用品：
研缽,、冰,、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀,、微量石英比色皿/96孔板,、可調式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑二：液體18mL×1瓶，4℃保存,。
試劑三：液體2.5mL×1瓶,，4℃保存。
試劑四：粉劑×1支,，﹣20℃保存,。
試劑五：液體30μL×1瓶,，﹣20℃保存。
混合試劑：臨用前配制,，將試劑四和試劑五轉移至試劑三中充分溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,。
試劑六：液體2mL×1管,，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1,、細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清,；按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液,，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，工作3s,，間歇10s,，工作35次），16000g 4℃離心20min,，取上清,，置冰上待測。
2,、組織處理：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，16000g 4℃離心20min,，取上清,，置冰上待測。
3,、血清（漿）樣品：直接檢測,。
PDC測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長到340 nm,，蒸餾水調零,。
2. 試劑二置于25℃水浴中預熱30min。
3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水,、20μL混合試劑,、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色,，記錄15s和75s的吸光值,，分別記為A1和A2。
4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液,、20μL混合試劑,、140μL試劑二和20μL試劑六,，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值,，分別記為A3和A4,。
注意：空白管只需測定一次。
PDC活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中,，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位,。
PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(Cpr×V樣) ÷T
=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位,。
PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T
=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W
（3）按細胞數量計算
活性單位定義：25℃中,，每104個細胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T
=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞數量
（4）按血清（漿）體積計算
活性單位定義：25℃中,，每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位,。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷V樣÷T
=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V總：反應體系總體積,，0.2mL=2×10-4 L,，V樣：加入反應體系中上清液體積，0.02mL,；V樣總：提取液體積，1 mL,；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）,，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒,；W ：樣品質量,； T：反應時間，1 min,。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中,，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。
PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(Cpr×V樣) ÷T
=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
活性單位定義：25℃中,，每克組織每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位,。
PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T
=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W
（3）按細胞數量計算
活性單位定義：25℃中，每104個細胞每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位,。
PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T
=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞數量
（4）按血清（漿）體積計算
活性單位定義：25℃中,，每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol NADH 氧化為1個酶活單位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V總×109}÷V樣÷T
=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]
ε：NADH摩爾消光系數,，6.22×103L/mol/cm,；d：96孔板光徑,，0.5 cm；V總：反應體系總體積,，0.2mL=2×10-4
L,，V樣：加入反應體系中上清液體積，0.02mL,；V樣總：提取液體積,，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）,，需要另外測定,，建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒；W ：樣品質量,； T：反應時間,，1 min。
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