脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶,，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達于各種組織細胞中,，在哺乳動物肝,、腎、腦,、肺和乳腺以及脂肪組織中表達豐富,。
測定原理：
FAS催化乙酰CoA,、丙二酰CoA和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP+,；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+沒有,；通過測定340nm 光吸收下降速率,，計算FAS活性。
自備儀器和用品：
研缽,、冰,、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀,、微量石英比色皿/96孔板,、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶,，－20℃保存,。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。
試劑二：粉劑×1瓶,。臨用前加入440μL試劑四,，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前加入440μL試劑四,，充分溶解,，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。
試劑四：液體20mL×1瓶, 4℃保存,。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前加入840μL試劑四,，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿,。12000g，4℃離心40min,，取上清置冰上待測,。
2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后12000g，4℃,，離心40min,，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定,。
FAS測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零,。
2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min,。
3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二,、4μL試劑三,、164μL試劑四和8μL試劑五，混勻后于340nm處測定吸光值,，記錄第30s和90s時吸光值,，分別記錄為A1和A2。△A測=A1-A2。
FAS活性計算：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位,。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T
=1608×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位,。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：37℃中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位,。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=1608×△A
ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時間，1min,。
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位,。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T
=3216×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：37℃中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位,。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位,。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109 )÷V樣÷T
=3216×△A
ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×103L/mol/cm,；d：96孔板光徑，0.5 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL=0.02 mL,；V樣總：提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1min。
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