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檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說明書

                                         微量法100管/48樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：                           

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶,，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一,。

測定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸,；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,，在 412nm處有特征吸光值,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑三：液體1.5mL×1支,，-20℃保存；

試劑四：液體28mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存,；

試劑六：粉劑×1支,，-20℃保存，臨用前加入1.2mL蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g,，4℃離心5min,。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min。

④        上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）,。

⑤        在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3秒,，間隔10秒,，重復(fù)30次）,，用于線粒體CS測定。

測定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定

（1）在試劑五中加入0.6mL無水乙醇和13mL試劑四，混勻,，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,；

（2）測定管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、220μL試劑五和10μL試劑六，混勻,，37℃反應(yīng)15min后立即測定吸光值A1,。

（3）對照管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑四和10μL試劑六,，混勻,，37℃

反應(yīng)15min后立即測定吸光值A2。

（4）計(jì)算ΔA=A1-A2,，每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對照管,。

CS活性計(jì)算：

a.        使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=23.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.0475×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2.4×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬,。

b.       使用96孔板測定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位,。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=47.5×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.095×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2.4×10^-4 L,；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬。

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