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脯氨酸脫氫酶（ Proline dehydrogenase，ProDH)試劑盒說明書

                                       微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ProDH是存在于線粒體內(nèi)的催化脯氨酸降解的關(guān)鍵酶,。脯氨酸是分布Z廣泛的一種滲透物質(zhì),，在脅迫條件下很多植物可以通過增加合成、減少降解而在體內(nèi)累積大量脯氨酸,，降低ProDH活性對(duì)于調(diào)節(jié)滲透平衡,、防止?jié)B透脅迫對(duì)植物造成傷害、清除自由基,、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有重要意義,。

測(cè)定原理：

利用異硫氰酸甲酯檢測(cè)ProDH催化的脫氫反應(yīng),，600nm處吸光值的吸光值的變化反映酶活性的高低。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑一：液體2 mL×1支， 4℃保存,；

試劑二：液體25mL×1瓶,， 4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶,， 4℃保存,；臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存,；

試劑四：粉劑×1瓶,， 4℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解待用,，用不完的試劑4℃保存,；

試劑五：粉劑×4支，4℃保存,；

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,，1500g 4℃離心15min，取上清液于一支新的EP管中,，加入一滴試劑一（用10μL的槍頭加入）,，渦旋混勻，冰浴放置30min后,，16000g 4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè),。

測(cè)定步驟：

1,、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至600nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2,、  樣本測(cè)定

（1）混合液的配制：首先將試劑三和試劑四配成溶液（見試劑的組成和配制），臨用前根據(jù)用量按照試劑二（V）：試劑三（V）：試劑四（V）=2.4（mL）：0.3（mL）：0.3（mL）的比例充分混勻,。（注意：現(xiàn)配現(xiàn)用,，用多少配多少），置于30℃水浴5min,；

（2）試劑五的配制：取試劑五一支，臨用前加入500μL蒸餾水充分溶解待用,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入35μL樣本,、15μL試劑五和150μL混合液,，混勻，立即記錄600nm處初始吸光值A1和10min后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1。

ProDH活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位,。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =57.14×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位,。

ProDH（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =57.14×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL,； V樣：加入樣本體積，0.035mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位,。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =114.29×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

ProDH（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =114.29×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL；V樣：加入樣本體積,，0.035mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,。

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