氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
動(dòng)物肝臟,、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應(yīng)肝,、腎的生理狀態(tài),。另外，氨基酸還能反應(yīng)灼傷,、傷寒等方面情況,。植物體內(nèi)氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時(shí)期氮代謝變化、植物對氮素的吸收,、運(yùn)輸,、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。
測定原理：
氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物,，在570 nm有特征吸收峰；通過測定570 nm吸光度,，來計(jì)算氨基酸含量,。
自備儀器及用品：
臺式離心機(jī)、水浴鍋,、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍,、研缽,、無水乙醇、冰和蒸餾水,。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1瓶,，4℃保存。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存,。
試劑三：粉劑×1瓶（棕色）,，4℃避光保存。臨用前加入667μL無水乙醇,，蓋緊后充分混勻,，再加入9.333 mL蒸餾水混勻，避光保存,。
試劑四：粉劑×1管,，4℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水,，充分溶解,。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶，臨用前加10 mL蒸餾水,，充分溶解,。1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，4℃避光保存,。
樣品中AA提?。?/span>
1. 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行室溫勻漿,，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP 管中,，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來水冷卻后,，8000g,，，4℃離心10min,，上清液置冰上待測,。
2. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復(fù)30次）,；8000g,，4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。
3. 血清等液體：直接檢測,。
測定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到570 nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2. 空白管：取EP管，加入10μL蒸餾水,，100μL試劑二,，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失）,，置于沸水浴中保溫15 min,，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測定吸光值,，記為A空白管,。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管,，加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品,，100μL試劑二，100μL試劑三和10μL試劑四,，混勻后蓋緊瓶蓋
（防止水分散失）,，置于沸水浴中保溫15 min,，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,，于570nm測定吸光值，記為A標(biāo)準(zhǔn)管,。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完,。
4. 測定管：取EP管，加入10μL上清液,，100μL試劑二,，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失）,，置于沸水浴中保溫15 min,，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測定吸光值,，記為A測定管,。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次,。
氨基酸含量計(jì)算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
氨基酸含量（μmol /mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)]÷（V樣×Cpr）
=1×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)] ÷（V樣總÷V樣）÷W
=1×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細(xì)胞數(shù)量）
=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按照液體體積計(jì)算
氨基酸含量（μmol /mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷V樣
=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度,，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,，0.01 mL,；W：樣品質(zhì)量,，g；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,，0.01 mL,；V樣總：樣品提取液總體積，1mL,；,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)] ÷（V樣×Cpr）
=1×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)]×（V樣總÷V樣）÷W
=1×(A測定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
氨基酸含量（μmol /104 cell）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細(xì)胞數(shù)量）
=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按照液體體積計(jì)算
氨基酸含量（μmol /mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷V樣
=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度,，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,，0.01 mL,；W：樣品質(zhì)量，g,；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,，0.01mL；V樣總：樣品提取液總體積,，1mL,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,。
注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒中試劑三,、試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制，且避光保存,，配制好未使用完的4℃保存且3天內(nèi)使用完畢,。
2. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),，如果測定的吸光值過高（高于2.5）,，用蒸餾水稀釋后再測定。
3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)在570nm處無吸收峰,，因此,，570nm處測定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。
4．最di檢出限為100μmol/L,。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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