一般酶標(biāo)儀的測定波長在400～750nm或800nm之間，可以滿足ELISA的顯色測定,。ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP),，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下,，經(jīng)HRP作用,，分別氧化為2，2,，—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌,。當(dāng)pH值為5.0左右時，DAB在450nm波長處有最大吸收,，當(dāng)pH值降為L0時,，最大吸收波長移至492nm，同時摩爾消光系數(shù)變大,，顯色加深,，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù),，如果HRP量少,，H：O：和TMB過量時，則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH,，即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌,，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此,，450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定常用的,。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動轉(zhuǎn)換的部件，可以同時安裝6～8片濾光片,，所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個波長,，有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大,。
除了這兩個基本濾光片外,，考慮到雙波長比色的需要，還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片,，其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇,。有時，有的實驗室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測定,，故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測功能,，此時需要一個340nm波長濾光片。此時,，酶標(biāo)儀的測定波長范圍就成為340—750nm或800nm,。
酶標(biāo)儀有單波長和雙波長檢測功能。有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測,。所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而“雙波長”則除了用對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定外,，同時用對特異顯色不敏感的波長如630nm進(jìn)行測定,，酶標(biāo)儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630nm波長下得到的吸光度是非特異的,，來自于板孔上諸如指紋,、灰塵、臟物等所致的吸收,。因此,，在ELISA比色測定中，最好使用雙波長,，且不必設(shè)空白孔,。
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