使用凍存管儲存樣本時,，嚴格要求應把凍存管放入液氮的氣相層或冰箱中保存,！如果凍存管儲存于液氮液體中，液氮有一定幾率會滲入凍存管內部,，復蘇時液氮氣化導致管內外壓力不平衡,，這樣極易造成凍存管的炸裂，并具有生物危害性,。
操作凍存管復蘇,，全程使用安全防護設備，建議穿實驗服,、戴棉質手套且在安全的實驗臺上進行操作,。條件允許情況下，請佩戴護目鏡或防護面罩,。由于夏季室內溫度會高于冬季，請格外小心。
凍存管使用不當,，會有爆管,、生物安全威脅及人身傷害等風險，請嚴格參照安全使用須知操作,！
01細胞凍存流程
1,、用預熱過的 PBS 對細胞進行沖洗，棄去 PBS 后,，加入含 EDTA 的胰酶消化液對細胞進行消化(消化液薄薄地覆蓋細胞表面即可,，消化液濃度須根據(jù)不同的細胞系進行調整)。
2,、37℃消化細胞 3–5 分鐘,，不可過度消化。
3,、一旦細胞從底部脫離,，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化，并用吸管輕輕吹打以重懸細胞,。
4,、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液以沉淀細胞，棄上清,，用含血清培養(yǎng)基對細胞沉淀進行重懸,。
5、對細胞進行計數(shù)(推薦 Neubauer chamber),。
6,、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液，棄上清,。用適當體積含血清培養(yǎng)基重懸細胞,。
7、將細胞重懸液以 1:1 比例與凍存液(60% 培養(yǎng)基,，20% FCS,，20% DMSO) 進行混合后轉移至 Cryo.sTM 凍存管中。凍存管中細胞的濃度應為 1–5 ×10^6細胞/ml,。
8,、含有細胞的凍存管須按照 −1 K/min 的冷卻速率進行冷凍。將凍存管插在含異丙醇的凍存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以實現(xiàn)上述要求,。如果 凍存液中含有其他類型的樣品時,，則需要將 Cryo.s 凍存管在−20℃，−70℃或者液氮的氣相層進行直接凍存,。為確保每個樣品的均一凍存效 果,，4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s凍存管需在−20℃過夜凍存后再轉移至 70℃或者液氮的氣相層。
9、然后將 Cryo.s 凍存管轉移至液氮罐,。為避免污染(例如支原體)并考慮到安全預防規(guī)范的要求,，建議將 Cryo.s 凍存管放置在液氮上方的氣相層而非液氮層。
02細胞復蘇流程
1,、從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于 37℃水浴中進行解凍,，解凍時間約 1–2min，解凍時需要不停搖動凍存管令其盡快融化,。此步解凍過程越快越好,。
2、將解凍好的細胞懸液轉移到 15 ml 離心管,，并立即添加一定量含血清培養(yǎng)基進行混合,。
3、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液,，棄去上清,。用適當體積的含血清培養(yǎng)基對細胞沉淀進行重懸后分裝到 1 個或多個細胞培養(yǎng)瓶中。
4,、請遵循細胞接種時的推薦濃度進行培養(yǎng),。
5、接下來的 12 個小時細胞需要靜置培養(yǎng),。
6,、細胞換液可在 24–48h 后進行。
