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前沿 | 安捷倫質(zhì)譜助力解析穿心蓮內(nèi)酯完整合成通路
2025 年 5 月 14 日,，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所孫偉團(tuán)隊(duì),、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所賈美榮團(tuán)隊(duì)與成都中醫(yī)藥大學(xué)本草基因組學(xué)研究院陳士林院士團(tuán)隊(duì)在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition，影響因子 16.6）在線發(fā)表題為“Completing the Biosynthesis of the Clinically Important Diterpenoid Andrographolide in Andrographis paniculata”的研究論文,。該研究通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合分析（基因組-轉(zhuǎn)錄組-代謝組）,，結(jié)合本氏煙草（Nicotiana benthamiana）瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)及酵母微粒體體外催化實(shí)驗(yàn)，成功從穿心蓮中鑒定出 4 個(gè)參與生物合成的細(xì)胞色素 P450 酶（CYP450s）,，首次完整解析了穿心蓮內(nèi)酯的生物合成途徑,，并實(shí)現(xiàn)該藥物在煙草體系中的異源合成。
研究背景
穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide）是從爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata）中提取的 ent- 半日花烷型二萜類單體化合物,，具有顯著的抗炎活性,，其工業(yè)化生產(chǎn)目前仍完全依賴植物提取。雖然穿心蓮內(nèi)酯的二萜骨架 ent-copalyl diphosphate（ent-CPP）已實(shí)現(xiàn)生物合成,，但其后續(xù)的氧化修飾機(jī)制長(zhǎng)期未被闡明,。
研究結(jié)果
團(tuán)隊(duì)前期研究表明,，穿心蓮內(nèi)酯的生物合成受到茉莉酸甲酯（MeJA）的誘導(dǎo)。茉莉酸甲酯處理?xiàng)l件下,，骨架合成基因 ApCPS2 表達(dá)模式和穿心蓮內(nèi)酯積累模式一致,。通過(guò)將茉莉酸甲酯處理后基因組注釋的 CYP450s 基因和 ApCPS2 進(jìn)行相關(guān)性分析，在 r>0.85 閾值下篩選到 20 個(gè)與 ApCPS2 表達(dá)高度相關(guān)的 CYP450 候選基因（圖 1）,。
圖 1. A 穿心蓮植物照片 B.MeJA 處理后穿心蓮幼苗中代謝物分析,。C. 生物合成途徑示意圖。D. 穿心蓮注釋 CYP450s 和 ApCPS2 表達(dá)水平之間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)（r>0.85）,。
將候選 CYP450s 逐一與 ent-copalol 合成基因（AstHMGR,，AgGGPPS 和 ZmCPS2）在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，僅有 ApCYP71D587 和 ApCYP71BE50 可催化 ent-copalol 產(chǎn)生新化合物,。通過(guò)分離純化確認(rèn) ApCYP71D587 催化 ent-copalol 形成 19-hydroxy-ent-copalol,；ApCYP71BE50 催化 ent-copalol 生成了主產(chǎn)物 ent-15，16-epoxy-labda-8（17）,，13（14）-diene,、ent-15，16-epoxy-labda-8（17）,，13（16）,，14-triene 以及副產(chǎn)物 19-dehydroxy-andrograpanin（圖 3）；考慮到 ApCYP71BE50 能夠催化 ent-copalol 形成內(nèi)酯環(huán),，研究人員將 ApCYP71D587、ApCYP71BE50 以及 ent-copalol 合成基因在煙草中進(jìn)行了共注射,，確認(rèn)在煙草中生成了合成路徑中的關(guān)鍵中間體—新穿心蓮內(nèi)酯苷元（andrograpanin）（圖 2）,。
圖 2. 穿心蓮內(nèi)酯合成示意圖
隨后，以新穿心蓮內(nèi)酯苷元作為底物對(duì)其余 CYP450s 進(jìn)行功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),，ApCYP706U5 催化新穿心蓮內(nèi)酯苷元生成 14-deoxyandrographolide,；ApCYP72F1 可催化新穿心蓮內(nèi)酯苷元生成 3-dehydroxy-andrographoide（圖 3）。進(jìn)一步將 ApCYP706U5 和 ApCYP72F1 與新穿心蓮內(nèi)酯苷元合成基因在煙草葉片共表達(dá)后觀察到了穿心蓮內(nèi)酯（andrographoide）的生成（圖 2）,。
圖 3. 藥用植物穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯生物合成推測(cè)路徑
研究結(jié)論
利用安捷倫的氣質(zhì)和液質(zhì)產(chǎn)品,，研究人員在酵母微粒體催化實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了上述 P450 的催化功能。同時(shí),，利用煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗(yàn)證了上述四個(gè) P450 對(duì)不同底物的催化功能,，提出了穿心蓮內(nèi)酯在藥用植物穿心蓮中可能存在生物合成路徑（圖 3）。該研究成果為理解二萜類次生代謝產(chǎn)物的生物合成,、穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的異源生物制造和穿心蓮新品種培育奠定了基礎(chǔ),。
專家團(tuán)隊(duì)
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中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所道地藥材品質(zhì)保障與資源持續(xù)利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孫偉研究員、協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物所賈美榮研究員,、成都中醫(yī)藥大學(xué)陳士林院士為該論文的通訊作者,。本草基因組學(xué)團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人陳士林院士 2022 年組織發(fā)布了千種本草基因組研究計(jì)劃,，在《創(chuàng)新》（The Innovation）、《自然-植物》（Nature Plants）,、《分子植物》（Molecular Plant）,、《自然-通訊》（Nature Communications）等國(guó)際著名刊物發(fā)表了一系列的草藥基因組學(xué)研究成果，極大地推動(dòng)了學(xué)術(shù)界從分子遺傳學(xué)層面理解中草藥中有效成分的合成,、轉(zhuǎn)運(yùn),、積累和調(diào)控，助力天然產(chǎn)物藥物的綠色生物合成以及高含量藥效成分品種的精準(zhǔn)選育,。該研究得到了安捷倫科技公司提供全程質(zhì)譜儀器（GC/Q-TOF,、LC/Q-TOF）和技術(shù)支持。
參考文獻(xiàn)
[1] Sun W, Wang S, Liang M, et al. Completing the Biosynthesis of the Clinically Important Diterpenoid Andrographolide in Andrographis paniculata[J]. Angewandte Chemie, e202425303.