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【技術(shù)方案】微孔板內(nèi)細(xì)胞固定和抗體染色自動(dòng)化解決方案
以往，我們使用顯微鏡做熒光成像的時(shí)候，常常將樣本放在載玻片上,。但是隨著樣本量增加,，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用 96 孔和 384 孔微孔板逐漸成為趨勢，這與高內(nèi)涵（high-content analysis,，HCA）分析不謀而合,。
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高內(nèi)涵分析是一種高通量識(shí)別并分析由與細(xì)胞相互作用的物質(zhì)所帶來的細(xì)胞表型變化的方法。這些物質(zhì)包括小分子,、受體配體和 RNAi,，它們可能引起——增加或減少特定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表型變化、G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的內(nèi)化,、核激素受體易位,、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化以及細(xì)胞形態(tài)的變化,。雖然通過明場成像（透射光）可以觀察一些細(xì)胞形態(tài)變化,，但更多的形態(tài)學(xué)變化需要使用更有針對(duì)性的染色方案，比如抗體或者小分子熒光探針,。
BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)支持高內(nèi)涵成像與分析
無論使用何種抗體和熒光染料的組合,，對(duì)于低背景的特異性染色，都需要一系列的試劑添加和清洗步驟來去除未結(jié)合的抗體或染料,。
安捷倫 BioTek 406 FX 洗板分液系統(tǒng)是一個(gè)模塊化的系統(tǒng),，具備分液和細(xì)胞清洗雙重功能。406 FX 可以通過觸控屏或者使用電腦上 LHC 軟件進(jìn)行控制和編程：
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快速清洗 96/384 孔板,，且無需更換洗頭,；
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最多 4 個(gè)注射器泵和 2 個(gè)蠕動(dòng)泵分液器的組合允許同時(shí)添加 6 種試劑；
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蠕動(dòng)泵結(jié)合 1μL 卡夾,，允許用戶最大限度的減少試劑制備量,；
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管路內(nèi)的試劑可回收；
注射器泵支持快速批量分液,。
406 FX 洗板分液系統(tǒng)
一臺(tái) 406 FX 即可完成 96/384 孔板中制備細(xì)胞樣品所需的試劑添加和清洗步驟,。成角度分液頭的獨(dú)特設(shè)計(jì)，有效保護(hù)單層細(xì)胞不受加液和清洗影響,。
下面我們就一起了解下 406 FX 細(xì)胞分液系統(tǒng)在如何代替手工,，完成在微孔板中固定和染色細(xì)胞的工作流程。
實(shí)驗(yàn)方法
1
細(xì)胞培養(yǎng)與接種
將 HT-1080 細(xì)胞和 NIH3T3 細(xì)胞通過 406 FX 的蠕動(dòng)泵 5μL卡夾分別接種到 96 孔板（黑色,，透明底,，貨號(hào)：204626-100，安捷倫）中,，再使用第二蠕動(dòng)泵添加不含細(xì)胞的完整培養(yǎng)基,，使得每個(gè)孔體積均為 200μL,。
2
細(xì)胞固定、透化與熒光染色
所有固定,、透化和熒光染色所需要的試劑添加和細(xì)胞清洗步驟均由 406 FX 來完成（圖 1）,。其中，對(duì)于昂貴的一抗和二抗,，使用蠕動(dòng)泵來添加,，管路中的試劑可回收。
用于透化細(xì)胞的固定劑和細(xì)胞洗液則使用注射器泵添加,。實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑,、抗體和染料和詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟請(qǐng)查看原文。
圖 1. 固定和染色工作流程
3
細(xì)胞成像分析
使用安捷倫 BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像和分析,。Cytation C10 將共聚焦光路與寬場顯微成像相結(jié)合,，對(duì)于寬場成像，Cytation C10 將 LED 光源與高性能濾光片 cube 直接耦合,，提供多色熒光成像,，在本次實(shí)驗(yàn)中使用 DAPI、GFP,、TRITC 和 CY5 四個(gè)熒光通道,。對(duì)于共聚焦，Cytation C10 使用激光器結(jié)合轉(zhuǎn)盤共聚焦的方式為有厚度的樣本提供更優(yōu)異的分辨率和光學(xué)層切能力,。
圖 2. HT-1080 細(xì)胞固定染色
使用 Agilent BioTek 406 FX 洗滌分配器進(jìn)行液體處理,，固定 HT-1080 細(xì)胞并對(duì)肌動(dòng)蛋白（紅色）、微管蛋白（綠色）,、細(xì)胞核（藍(lán)色）和線粒體（橙色）進(jìn)行染色,。使用 Agilent BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)用 40 倍物鏡拼接成像（2×2）。
結(jié)果與討論
1
可變細(xì)胞數(shù)接種準(zhǔn)確性驗(yàn)證
通過接種不同體積的細(xì)胞懸液,，可以改變孔中的細(xì)胞數(shù)量,。本實(shí)驗(yàn)中，使用 406 FX 初級(jí)蠕動(dòng)泵將相同細(xì)胞濃度的 NIH 3T3 細(xì)胞以不同體積接種至 96 孔板中,，然后使用二級(jí)蠕動(dòng)泵向孔內(nèi)添加培養(yǎng)基,，至每孔體積均為 200μL，固定細(xì)胞并使用 Hoechst 33342 染色后通過成像進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，計(jì)數(shù)結(jié)果與接種細(xì)胞時(shí)基于細(xì)胞濃度預(yù)期的細(xì)胞數(shù)量具有良好的相關(guān)性（圖 3）,。
圖 3. 可變細(xì)胞數(shù)接種
2
編程的靈活性驗(yàn)證
406 FX 可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，在 2 個(gè)蠕動(dòng)泵和 4 個(gè)注射器泵中靈活選擇進(jìn)行程序設(shè)置,，比如實(shí)現(xiàn)一個(gè)簡化版的固定和染色步驟,。如圖 4 中的 NIH3T3 細(xì)胞表達(dá) GFP，僅使用 DAPI 和 Texas Red 鬼筆環(huán)肽進(jìn)行復(fù)染,，其固定和染色過程僅使用了洗板模塊,，一個(gè)蠕動(dòng)泵和兩個(gè)注射器泵,。
圖 4. 406 FX 固定和染色后的三色熒光成像圖。表達(dá) GFP 的 NIH 3T3 細(xì)胞用 exas Red phalloidin（actin）染色,，用 DAPI 染核。10 倍物鏡拍攝,。
3
蠕動(dòng)泵獨(dú)立分液,，降本增效
406 FX 蠕動(dòng)泵的卡夾采用 8 通道設(shè)計(jì)，8個(gè)通道既可以分裝相同的試劑,，又可以分裝不同的試劑,。8個(gè)通道獨(dú)立使用，在用來篩選熒光染料時(shí)可以節(jié)約染料和細(xì)胞,，非常方便,。圖 5 展示的是使用蠕動(dòng)泵將不同的熒光染料組合加入到 4 個(gè)細(xì)胞孔里染色后的細(xì)胞圖像。
圖 5. 不同熒光標(biāo)記的 phalloidin 復(fù)染結(jié)果
該方法也同樣適用于檢測抗體特異性，檢測不同抗體的特異性時(shí)通常需要使用抗體陰性對(duì)照,。如圖 6 所示,，通過 406 FX 的一級(jí)和二級(jí)蠕動(dòng)泵將6種不同的抗體混合物分別加入兩列細(xì)胞孔中，產(chǎn)生陰性對(duì)照：缺乏 rabbit anti-Tom20 一抗和對(duì)應(yīng)二抗的孔不顯示紅色熒光,，同樣,，缺乏 mouse anti-tubulin 和對(duì)應(yīng)二抗的孔不顯示綠色熒光。
圖 6. 抗體特異性驗(yàn)證
結(jié)論
高內(nèi)涵分析目前在藥物發(fā)現(xiàn)過程中發(fā)揮著重要作用,?；陲@微圖像的分析歷來需要大量的手工樣品處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力,，并且容易產(chǎn)生可能導(dǎo)致偽影的錯(cuò)誤處理,。在這些繁瑣、重復(fù)的步驟中使用自動(dòng)化液體處理設(shè)備,，不僅提高了效率,、減少了技術(shù)人員偏差,，同時(shí)也讓研究人員得以將時(shí)間用在更重要的工作上。
406 FX 體積小巧,，可以放入生物安全柜使用,，進(jìn)行無菌操作，也可以與自動(dòng)化設(shè)備整合,，進(jìn)行自動(dòng)化程度更高的樣本制備流程,。
Agilent BenchCel 微孔板處理器與 Agilent BioTek 406 FX 洗板分液系統(tǒng)和 Cytation 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)集成
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【技術(shù)方案】微孔板內(nèi)細(xì)胞固定和抗體染色自動(dòng)化解決方案