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前沿 | 北京協(xié)和醫(yī)學院張金蘭/蔣建東團隊揭示燈盞乙素通過調控Pdk-Pdc軸及線粒體有氧糖代謝挽救線粒體損傷
線粒體功能障礙被認為是衰老,、阿爾茨海默病（AD）和血管性癡呆（VAD）等的共同致病機制。然而,，目前還沒有發(fā)現(xiàn)特定的潛在分子可以通過調節(jié)線粒體代謝和修復線粒體損傷來治療神經系統(tǒng)疾病。
燈盞乙素（SG）是來源于燈盞細辛中的一種黃酮類化合物,，SG 已被證明具有廣泛的心腦血管及神經變性保護藥理活性,。而線粒體是細胞的能量工廠,，線粒體生物能缺陷及其導致的葡萄糖基礎代謝降低是促進神經退行性病變等神經系統(tǒng)疾病的關鍵病理生理調節(jié)因子之一。神經細胞和腦組織的功能高度依賴線粒體功能,，神經遞質代謝與神經細胞的能量代謝密切相關,，從能量代謝角度研究 SG 對線粒體及神經系統(tǒng)的保護作用具有重要意義。
近期北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所/醫(yī)藥生物技術研究所張金蘭教授/蔣建東院士團隊在 Advanced Science（IF=15.1）上發(fā)表了題為“Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis”的研究[1],，該研究首次發(fā)現(xiàn)了燈盞乙素靶向腦組織線粒體丙酮酸脫氫酶激酶-丙酮酸脫氫酶復合物軸（PDK-PDC）調控線粒體有氧代謝,，能夠挽救受損的線粒體，進而發(fā)揮神經細胞保護的作用,。研究結果表明,，改善線粒體生物能缺陷的活性成分對神經系統(tǒng)疾病的治療具有重要價值。
整體研究策略
研究團隊建立了靶向線粒體代謝及功能的活性成分發(fā)現(xiàn)和藥效評價方法：
首先基于活細胞能量代謝分析發(fā)現(xiàn)對線粒體有氧糖代謝有調控作用的活性物質
同時開展亞細胞水平線粒體蛋白組學,、代謝組學和 13C 同位素標記代謝流示蹤研究,，明確活性物質調控的代謝物流向和通量，以及調控的代謝酶
進一步基于激酶活性分析,、質譜分析和分子生物學實驗確證蛋白-活性成分的結合作用及結合口袋,，最終揭示燈盞乙素靶向腦組織線粒體、調控線粒體有氧代謝及挽救受損的線粒體,，進而發(fā)揮神經細胞保護的作用機制
研究結果
活細胞能量代謝分析
采用安捷倫 Seahorse XFe96 analyzer 進行活細胞能量代謝分析,，活細胞能量代謝實時監(jiān)測分析發(fā)現(xiàn)，SG 可同時增強糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）過程,，來緩解線粒體損傷導致的葡萄糖代謝低下,。
圖 1. NaN3 誘導線粒體 OXPHOS 損傷和 SG 處理后實時 ECARs 和 OCRs 的評估。A）糖酵解應激試驗結果,。B）對照組,、模型組和 SG 治療組糖酵解和糖酵解能力的 ECARs。
蛋白組學研究
提取大鼠腦組織中的線粒體進行非標記定量蛋白質組學研究,，結果顯示線粒體組間差異蛋白主要與線粒體電子呼吸鏈及其上游糖酵解和 TCA 循環(huán)途徑密切相關,。這表明 SG 可增強線粒體有氧呼吸及其上游途徑，增加氫質子和電子供應,，增強 OXPHOS 相關蛋白功能并最終降低線粒體損傷,。
線粒體蛋白質組學揭示了 SG 對氧化磷酸化和能量代謝途徑的調節(jié)作用。
代謝組學與代謝流研究
基于上述研究結果,，進一步采用安捷倫 1290UHPLC/6550Q-TOF 開展了代謝組學和代謝流研究,，以驗證 SG 對線粒體損傷期間生物能缺乏的調節(jié)作用。
代謝組學分析表明 SG 顯著增加了 TCA 循環(huán)中富馬酸和蘋果酸的豐度,，以及連接糖酵解和 TCA 循環(huán)的關鍵代謝物丙酮酸的豐度,。
圖 2. A：主成分分析（PCA）顯示，對照組、模型組和 SG 組差異顯著,；B：27 種代謝物涉及的能量代謝相關途徑分析
代謝流分析：對 SK-N-SH（人神經母細胞瘤細胞）細胞的糖酵解和三羧酸循環(huán)通路開展了 [13C6]-葡萄糖示蹤分析,。結果顯示，SG 作用能顯著逆轉線粒體損傷下糖酵解過程中 [13C6]-葡萄糖-6-磷酸和 [13C3]-丙酮酸的豐度改變,，而 [13C3]-乳酸豐度無顯著差異,，表明糖酵解增強并未通過乳酸代謝途徑增加能量供應，而主要流向丙酮酸代謝,。尤為重要的是,，SG 顯著增強了 [13C3]-丙酮酸到 [13C2]-乙酰輔酶 A 的代謝流量，從而增強了線粒體葡萄糖源的有氧呼吸,。在 TCA 循環(huán)中,，SG 顯著逆轉了 [13C4]-琥珀酸、[13C4]-富馬酸和 [13C4]-蘋果酸代謝流量,?？傊髡甙l(fā)現(xiàn) SG 通過 PDK-PDC 軸調節(jié) [13C3]-丙酮酸到 [13C2]-乙酰輔酶 A 的流量是 SG 對抗線粒體 OXPHOS 損傷的關鍵點,。
圖 3. 13C MFA 和 western blotting 結果顯示 SG 能夠調節(jié)葡萄糖-丙酮酸 - TCA 循環(huán)過程相關的丙酮酸代謝
蛋白-活性成分的結合作用確證
基于激酶活性評估結果,，進一步結合分子對接、免疫共沉淀（co-IP）,、限制性蛋白水解-質譜（Lip-MS）,、藥物親和反應的靶點穩(wěn)定性（DARTS）和細胞熱轉移分析（CETSA）等實驗，作者得出結論,，SG 與 PDK2 蛋白相互作用,，并可能通過與 PDK2 的硫酰胺結合口袋（lipoamide-binding）結合來抑制其活性。
為驗證 SG 通過調節(jié) PDK-PDC 軸發(fā)揮線粒體保護和神經保護作用功能,，作者構建了 shPDK2 SK-N-SH 細胞系（PDK2 基因敲低的 SK-N-SH 細胞系）,，發(fā)現(xiàn) SG 以 PDK2 為靶標對疊氮鈉（NaN3）誘導的線粒體膜電位損傷和線粒體有氧呼吸損傷發(fā)揮保護作用。此外,，作者還通過蛋白質組學研究了 SG 對線粒體損傷引起細胞死亡的影響,。差異蛋白在生物學過程分析中與多種凋亡過程有關。B 細胞淋巴瘤（Bcl-2）家族的一組蛋白質與腦缺血中神經元死亡的調節(jié)密切相關,。Bcl-2 蛋白家族是線粒體外膜通透性的主要調節(jié)因子,，在內在凋亡途徑中發(fā)揮關鍵作用。細胞色素 c 被釋放到胞質溶膠中,，并通過細胞凋亡觸發(fā)程序性細胞死亡,。細胞色素 c 的釋放及其介導的細胞凋亡由 Bcl-2 家族控制。
在本研究中,，作者發(fā)現(xiàn) SG 在不同濃度下顯著降低了由線粒體損傷引起的對照組 SK-N-SH 細胞凋亡,，但在 shPDK2 SK-N-SH 細胞中沒有觀察到這種現(xiàn)象,。同時，蛋白免疫印跡實驗證實了線粒體損傷和 SG 給藥對 Bcl-2 蛋白,、細胞色素 c 和其他凋亡相關蛋白的影響，表明 SG 通過靶向 PDK2 調節(jié)線粒體依賴性細胞凋亡,。
綜上,，該研究探索了新的潛在治療方法：基于 PDK-PDC 軸治療大腦低灌注引起的神經損傷和認知障礙，并發(fā)現(xiàn) SG 通過特異性靶向 PDK2 發(fā)揮線粒體保護和抗凋亡活性,。
圖 4. SG 調節(jié) PDK-PDC 軸和線粒體葡萄糖氧化發(fā)揮線粒體保護和抗凋亡活性
結論與展望
本研究開展了靶向 PDK-PDC 軸調控線粒體能量代謝的活性成分發(fā)現(xiàn)和機制研究工作：
基于組織病理,、線粒體形態(tài)、線粒體關鍵參數(shù),、活細胞能量代謝分析等發(fā)現(xiàn)對線粒體有氧糖代謝調控作用的活性物質燈盞乙素
同時開展線粒體蛋白組學,、代謝組學和 13C 同位素標記代謝流研究，發(fā)現(xiàn) SG 調控的代謝物通路和關鍵代謝物流量及其調控的代謝酶
然后基于激酶活性分析,、質譜分析和分子生物學實驗確證蛋白-小分子結合作用,。通過以上研究發(fā)現(xiàn)了 SG 發(fā)揮神經保護的作用機制及靶點，即 SG 通過抑制 PDK2 增強 PDK-PDC 軸功能,，促進了線粒體有氧糖代謝和線粒體膜電位,，并進一步調節(jié)線粒體依賴性細胞凋亡發(fā)揮神經保護作用
本研究采用多組學、代謝流結合細胞能量代謝分析,，同時與多種分子生物學實驗交叉驗證揭示了燈盞乙素通過調控 Pdk-Pdc 軸及線粒體有氧糖代謝挽救線粒體損傷的機制,，為基于線粒體 PDK2 靶標的神經保護作用藥物開發(fā)提供了新策略。
* 張金蘭研究員和蔣建東院士為該論文的共同通訊作者,；生寧副研究員,、博士研究生張智慧與鄭浩是該論文的共同第一作者。
參考文獻：
[1] Sheng N, Zhang Z, Zheng H, Ma C, Li M, Wang Z, Wang L, Jiang J, Zhang J. Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis. Adv Sci. 2023 Sep 26:e2303584.