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藥用輔料分析與質(zhì)量控制 ——UHPLC/Q-TOF結(jié)合PolymerStudio 軟件進(jìn)行吐溫降解產(chǎn)物的研究
研究背景
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近年來(lái)，由于輔料降解或輔料中含有的過氧化物活性雜質(zhì)與 API 發(fā)生反應(yīng)等造成藥物質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道出現(xiàn)增加的趨勢(shì)。吐溫（學(xué)名聚山梨酯），是脫水山梨醇聚氧乙烯與脂肪酸酯化后產(chǎn)生的一系列混合物，是常用的藥用輔料,，特別是在抗體等生物制劑中。已有很多文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于吐溫降解造成抗體制劑中形成可見異物或不溶性微粒的問題,。
吐溫有兩個(gè)主要的降解通路：水解和氧化,。吐溫水解通常表現(xiàn)為酯化產(chǎn)物尤其是高酯化產(chǎn)物的減少，低聚合度聚氧乙烯（POE）的增加,、游離脂肪酸以及其它不完全水解產(chǎn)物的產(chǎn)生,。吐溫的氧化降解常見于吐溫 80，因?yàn)橛退嶂胁伙柡碗p鍵的存在,，容易受到 pH 值和金屬離子等因素的影響發(fā)生氧化,，產(chǎn)生羥基化物、環(huán)氧化物,、過氧化物等一系列氧化產(chǎn)物,。根據(jù)特定的降解產(chǎn)物來(lái)推測(cè)解吐溫的降解通路，并在藥物開發(fā)階段采取有針對(duì)性的控制策略對(duì)于藥物制劑開發(fā)和質(zhì)量控制很重要,。
安捷倫與科邁恩以及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所合作建立了一套完整地針對(duì)吐溫組成成分及其降解雜質(zhì)的精細(xì)表征,，通過 UHPLC-6500 系列 Q-TOF MS 液質(zhì)聯(lián)用儀，配合 PolymerStudio 聚合物分析軟件和專用數(shù)據(jù)庫(kù)，為制劑處方篩選和工藝優(yōu)化提供了有力工具,。
圖 1. 吐溫及其降解雜質(zhì)的全面快速分析方案
吐溫水解
吐溫降解初期的表現(xiàn)之一是亞類成分發(fā)生明顯變化,，這些變化通常由于吐溫的水解產(chǎn)生，pH 值和酯酶的存在可能導(dǎo)致或加速吐溫的水解,，主要表現(xiàn)為高酯化成分減少,、酯化度降低、聚氧乙烯（POE）等未酯化成分含量增加且聚合度降低等,。
實(shí)驗(yàn)測(cè)試了吐溫 20 在制劑酸性環(huán)境下不同時(shí)間點(diǎn)的精細(xì)組成變化情況：從未酯化區(qū)域看,，聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯異脫水山梨醇（PI）和聚氧乙烯脫水山梨醇（PS）的相對(duì)含量明顯增加,，并且隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而繼續(xù)升高,，聚合度也有明顯降低（可能與聚氧乙烯水解有關(guān)）。從單酯含量看,，辛酸單酯,、癸酸單酯和月桂酸單酯的相對(duì)含量變化較小，肉豆蔻單酯,、棕櫚單酯和油酸單酯的含量隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而明顯降低,。雙酯及更高酯化度的化合物，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),，信號(hào)強(qiáng)度明顯減小甚至消失,。
圖 2. 吐溫 20 在酸性環(huán)境下不同時(shí)間點(diǎn)的 TIC
實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了針對(duì)吐溫 80 的酯酶水解，觀察到了未酯化成分 POE,、PI 和 PS 含量的增加，聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯（PSTO）和四油酸酯（PSEO）相對(duì)含量的明顯減少,，并觀察到了（異）脫水山梨醇母核水解的產(chǎn)物,。另外，除了精細(xì)組成的變化,，吐溫水解直接表現(xiàn)為酯化度的降低,，可以從 PolyPattern 軟件分析報(bào)告中直接讀出。本例中吐溫 80 經(jīng)過酯酶水解后,，平均酯化度從 1.57 降至 0.71,，而平均聚合度變化較小（從 21.38 微弱下降至 19.95）,，表明吐溫 80 的酯酶水解,，以高酯化成分水解脫油酸為主，POE 鏈幾乎沒有水解,。
吐溫的氧化降解及降解產(chǎn)物表征
吐溫 80 因其脂肪酸鏈存在不飽和雙鍵,，在高溫、光照和金屬離子等影響下，可能發(fā)生一系列的氧化反應(yīng),，生成脂肪酸鏈變化的氧化產(chǎn)物,。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所張金蘭老師課題組今年在 Anal. Chem. 上發(fā)表文章，詳細(xì)探討了吐溫 80 的 32 類 348 種氧化雜質(zhì),，優(yōu)化了 UHPLC-Q/TOF 結(jié)合 AIM（全離子 MS/MS,，All Ions MS/MS）的表征技術(shù)，建立了保留時(shí)間-結(jié)構(gòu)特征鑒別模型,，將高分辨質(zhì)譜信息,、同位素分布、特征碎片離子及保留時(shí)間模型應(yīng)用于吐溫 80 氧化產(chǎn)物的鑒定,。
上述研究工作,，已經(jīng)同步寫入 PolymerStudio 軟件數(shù)據(jù)庫(kù)，用于吐溫 80 氧化產(chǎn)物的全面快速表征,。下圖展示了某生物制劑中吐溫 80 氧化產(chǎn)物的相對(duì)含量分析,，占比較高的氧化雜質(zhì)分別為聚氧乙烯脫水山梨醇單羥基油酸酯（PSMH）、聚氧乙烯異脫水山梨醇單羥基油酸酯（PIMH）和聚氧乙烯異脫水山梨醇雙羥基油酸酯（PIDH）,。
圖 3. 某生物藥物中吐溫 80 各個(gè)亞類氧化雜質(zhì)的相對(duì)含量
特殊降解產(chǎn)物及未知物鑒定
在強(qiáng)降解等特殊實(shí)驗(yàn)中,，我們可能觀察到一些未知降解產(chǎn)物。這時(shí)可以利用 Q-TOF 的未知物鑒定能力,，通過準(zhǔn)確質(zhì)量和同位素信息,，推測(cè)未知物的分子式，再結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜特征碎片信息,，推測(cè)未知物可能的結(jié)構(gòu),。下圖展示了在吐溫 80 的強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)中，除了觀察到 POE 含量增加,，聚合度降低,，還出現(xiàn)了一系列 POE 的氧化產(chǎn)物，可以利用高分辨質(zhì)譜信息推測(cè)其分子式及可能的結(jié)構(gòu),。
圖 4. 吐溫 80 強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)后 POE/PS/PI 的對(duì)比（右圖）及推測(cè)的 POE 氧化產(chǎn)物的質(zhì)譜信息（左圖）
結(jié)語(yǔ)
安捷倫 UHPLC-6500 系列 Q-TOF 質(zhì)譜結(jié)合 PolymerStudio 聚合物分析軟件,，可以全面快速表征吐溫及其常見降解產(chǎn)物，一方面有利于揭示吐溫的降解途徑并探究其可能的降解原因,，另一方面可以全面探討環(huán)境因素和存放時(shí)間等對(duì)吐溫降解的影響,，為制劑開發(fā)、工藝優(yōu)化以及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了有力的工具,。