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應(yīng)用文集｜完整蛋白質(zhì)和亞基純度“柱”力提高生物制藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性

時(shí)間：2022-11-23 閱讀：670

反相色譜仍然是色譜工作者“武器庫(kù)"中最有價(jià)值的工具之一,。這是一種廣為人知的技術(shù),，依賴于分析物和固定相之間的疏水相互作用,。對(duì)于完整蛋白質(zhì)，該技術(shù)使用有機(jī)溶劑梯度作為流動(dòng)相,，通常使用離子對(duì)試劑,。在這些條件下，分子很可能發(fā)生變性,。這是一種靈敏的分析技術(shù),，因?yàn)闃悠繁Ａ粼谏V柱上得到濃縮,，且適用于質(zhì)譜分析,。因此，該技術(shù)適用于測(cè)定完整蛋白質(zhì)的精確質(zhì)量,。

對(duì)于大分子蛋白質(zhì)（例如單克隆抗體）,，甚至對(duì)于較小的片段（例如重鏈和輕鏈或 IgG 分子的 Fab 和 Fc 區(qū)域），推薦使用大孔徑色譜柱,。安捷倫能夠提供多種配置的 300 ? 和 450 ? 產(chǎn)品,，包括全多孔、采用表面多孔顆粒的 Poroshell 技術(shù)以及一系列烷基鍵合相,。鍵合相通常具有較短的碳鏈長(zhǎng)度（C8 或 C4/C3）或具有更多獨(dú)特的配體,，例如可提供不同選擇性的二苯基。由于反相色譜分析準(zhǔn)確度高,，因此可以使用完整蛋白質(zhì)和片段分析來(lái)比較生物治療藥物的生物仿制藥與原研藥,。然而,，始終需要執(zhí)行額外的測(cè)試以鑒定可能檢出的不同異構(gòu)體的具體位置。

色譜柱選擇

選擇用于完整蛋白質(zhì)分析的反相色譜柱時(shí)需要考慮多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的因素：樣品分子量和最適合的填料孔徑,，色譜柱固定相,，所用的儀器（特別是檢測(cè)器的類型），流動(dòng)相條件,，以及速度或通量要求等,。

分析物分子越大，則需要越大的孔徑,。除一些例外情況,，用于完整蛋白質(zhì)分析的孔徑通常為 300–500 ?。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),，孔徑至少應(yīng)為蛋白質(zhì)流體動(dòng)力學(xué)半徑的三倍,。AdvanceBio RP-mAb 色譜柱具有 450 ? 的孔徑，ZORBAX RRHD 300 ?,、ZORBAX 300SB 和 Poroshell 300 均具有 300 ? 的孔徑,，而 PLRP-S 提供多種孔徑。雖然 1000 ? 的 5 µm PLRP-S 色譜柱孔徑明顯大于常用于完整蛋白質(zhì)分析的色譜柱,，但是該色譜柱可為完整蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段分析提供優(yōu)異的結(jié)果,。

對(duì)于反相色譜柱，選擇色譜柱固定相的通用指南是,，分子量越大,，使用的烷基鏈應(yīng)越短。因此,，C18 色譜柱常用于多肽分析,，而 C8、C4 和 C3 色譜柱常用于完整蛋白質(zhì)分離,。除線性烷基鏈以外,，AdvanceBio RP-mAb、ZORBAX RRHD 300 和 ZORBAX 300SB 色譜柱可提供二苯基固定相,。有時(shí),，二苯基固定相的不同選擇性可提供所需的分離。PLRP-S 是一種聚合物填料而不是硅膠基填料,。它提供典型的反相分離以及略有不同的選擇性和寬 pH 耐受性,。