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準(zhǔn)確定量分析基因治療制劑中轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺（PEI）殘留
生物制藥領(lǐng)域的浪潮,，從單抗,、雙抗、ADC 等抗體藥物的研發(fā)拓展到基因治療和細(xì)胞治療,，以及現(xiàn)在異?；馃岬?mRNA 疫苗領(lǐng)域和寡核苷酸藥物等。
聚乙烯亞胺（PEI）是一類(lèi)陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染載體,，在基因治療方法開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)中,，可通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，還可以在貼壁細(xì)胞系中用于病毒載體生產(chǎn)（腺相關(guān)病毒,、慢病毒,、腺病毒等）,。具有基因轉(zhuǎn)染效率高，易于從溶酶體中逃逸等優(yōu)點(diǎn),。但是 PEI 具有一定的毒性,，其不易在體內(nèi)生物降解的缺點(diǎn)受到了研發(fā)人員的關(guān)注，因此大家會(huì)嚴(yán)格控制 PEI 在基因治療制劑中的殘留,，將潛在的風(fēng)險(xiǎn)降到低,。為了滿(mǎn)足大家對(duì) PEI 痕量殘留監(jiān)控的急切需求，我們開(kāi)發(fā)了 HPLC-ELSD 方法準(zhǔn)確定量分析制劑中轉(zhuǎn)染劑 PEI 的殘留,。
什么是 PEI,？
PEI 是水溶性高分子聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，沒(méi)有顯著的紫外吸收的基團(tuán),，且?guī)в写罅康恼姾?。基于此特性,，安捷倫推出液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）聯(lián)用技術(shù),，適用于分析無(wú)法通過(guò)紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定的半揮發(fā)性及非揮發(fā)性化合物，特別是對(duì)于缺乏紫外吸收基團(tuán)且不易揮發(fā)的 PEI 有較高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性,。
實(shí)驗(yàn)樣品分析
準(zhǔn)備 PEI 的對(duì)照品溶液,，可以看到不同分子量的 PEI(PEI-25kDa和PEI-40kDa)在安捷倫 Poroshell HPH-C18 色譜柱上均有較好的保留。
圖 1 不同分子量 PEI 的色譜圖
PEI 為了準(zhǔn)確定量實(shí)際樣品溶液中 PEI 的殘留,，我們配制了一系列不同濃度的 PEI 對(duì)照品溶液,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
圖 2 一系列不同濃度的 PEI 色譜圖
圖 3 PEI 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（濃度范圍 0.01-0.1 mg/mL）
在此色譜條件下,，PEI 在 ELSD 檢測(cè)器上有較高的靈敏度，濃度 0.001 mg/mL,，可以得到 S/N=42,，*測(cè)定制劑中痕量 PEI 殘留的要求。
圖 4 濃度 0.001 mg/mL PEI 的色譜圖
在實(shí)際樣品分析過(guò)程中,，制劑中含量較高的緩沖鹽,，以及前處理后殘留的其他物質(zhì)在色譜柱上沒(méi)有保留，在死時(shí)間出峰,，而 PEI 與色譜柱具有較強(qiáng)的作用力,，通過(guò)快速的有機(jī)溶劑梯度變化進(jìn)行洗脫，可以得到很好的分離,，PEI 的加標(biāo)回收率在 90%-110%之間,。
圖 5 實(shí)際樣品及加標(biāo)樣品色譜圖
該方法分離度好，靈敏度高,，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系,、精密度和準(zhǔn)確度,，保留時(shí)間和峰面積的 RSD 分別在 0.1%和 1.6%范圍內(nèi)。
利用上面的 HPLC-ELSD 分析方法,，可以很好地滿(mǎn)足目前對(duì)制劑中痕量 PEI 殘留的分析,，同時(shí)考慮到實(shí)際樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，在色譜柱之后和 ELSD 之前,，安裝多功能閥,，通過(guò)軟件設(shè)置切換時(shí)間，將 4min 之前高濃度基質(zhì)切換到廢液中,，4min 之后待測(cè) PEI 切到 ELSD 中進(jìn)行檢測(cè),。既準(zhǔn)確測(cè)定了痕量 PEI，又避免了基質(zhì)污染 ELSD 檢測(cè)器,，保證了該方法的重現(xiàn)性,。
推薦儀器
HPLC-ELSD 聯(lián)用技術(shù)采用全新 1290 Infinity II ELSD 檢測(cè)器，包括特殊光電倍增管以及激光器件,，使其在靈敏度提高的同時(shí),，動(dòng)態(tài)范圍提高 90 倍，而且其*的高精度玻璃噴頭設(shè)計(jì)為峰面積重現(xiàn)性提供了保證,。
液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器
出色的靈敏度
新的 1290 Infinity II ELSD 檢測(cè)器配置性能出眾的激光光源,，靈敏度比常規(guī) ELSD 高出 10 倍，更適用于痕量分析,。
極佳的穩(wěn)定性
經(jīng)過(guò)優(yōu)化的安捷倫 ELSD 檢測(cè)器具有出色的穩(wěn)定性,，使大部分分析物獲得優(yōu)異的重現(xiàn)性，提供可靠,、準(zhǔn)確的分析結(jié)果,。
結(jié)語(yǔ)
與此同時(shí)，為滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)迅速發(fā)展的生物制藥行業(yè)對(duì)輔料,、工藝殘留和遞送載體等分析提出的更高要求,，安捷倫應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出一系列解決方案，包括 mRNA 疫苗和寡核苷酸藥物遞送載體的分析,，治療性蛋白藥物制劑中表面活性劑吐溫 20 或吐溫 80 ,、穩(wěn)定劑泊洛沙姆 188、凍干保護(hù)劑蔗糖,、氨基酸等輔料成份的分析,；以及消泡劑（二甲基硅油）和裂解劑（Triton X-100）等生產(chǎn)工藝殘留分析。
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1 采用 Agilent 1290 Infinity II ELSD 同時(shí)定量分析治療性蛋白藥物制劑中吐溫 80 （聚山梨酯 80）和泊洛沙姆 188
2 使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (HPLC-ELSD) 對(duì)生物制劑中的泊洛沙姆 188 進(jìn)行定量分析
3 安捷倫生物制藥輔料及生產(chǎn)工藝殘留分析解決方案
4 使用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法 (RP-HPLC-ELSD) 對(duì) PEG 偶聯(lián)重組蛋白注射劑中的吐溫 20（聚山梨酯 20）進(jìn)行分析