雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點處的光子密度是最高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔,，提高了熒光檢測效率,。
從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：
光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對活體細胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究；
穿透能力強：相對于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；
高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收僅局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；
漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；
熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦針孔）,，這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高,；
圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，大大降低了散射的干擾,；
光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質進行成像研究；
避免組織自發(fā)熒光的干擾,，獲得較強的樣品熒光：生物組織中的自發(fā)熒光物質的激發(fā)波長一般在350~560nm范圍內,，采用近紅外或紅外波段的激光作為光源，能大大降低生物組織對激發(fā)光吸收,。
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