Cell Counting Kit-8

Catalog Number：P11110

01/產(chǎn)品概述

LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110，簡稱CCK-8或CCK8試劑盒,，是一種基于WST-8（水溶性四唑鹽,，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）而廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒,，是MTT,、XTT、MTS等的優(yōu)良替代方法,。

　　WST-8是一種類似于MTT的化合物,，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan(圖1),。對于相同起始量的細胞,，細胞增殖越多越快,，則顏色越深,；細胞毒性越大，則顏色越淺,。對于同種細胞,，顏色的深淺(生成的formazan量)與細胞數(shù)目呈線性關(guān)系(圖3)。

圖1.WST-8檢測原理圖（EC=electroncouplingreagent,，即電子耦合試劑）

　WST-8是MTT的一種升級替代產(chǎn)品,，和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有以下明顯的優(yōu)點：

　　(1)MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的,，需要有特定的溶液來溶解,，而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,，可以省去后續(xù)的溶解步驟,，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。

　　(2)WST-8比XTT,、MTS更加穩(wěn)定,，使實驗結(jié)果更加可靠。

　　(3)WST-8和MTT,、XTT等相比,，線性范圍更寬，靈敏度更高,。

　　LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110為即用型試劑,，使用方法十分便捷，無須再進行任何配制等操作,，無須使用同位素,，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)即可完成。不必洗滌細胞,，不必收集細胞,，也不必采用額外的步驟溶解formazan，可以用于大批量樣品的檢測。同時,，WST-8對細胞無明顯毒性,，加入CCK-8溶液顯色后，可以在不同時間反復(fù)用酶標儀讀板,，使檢測時間更加靈活,，便于找到最佳測定時間。LeapWalCellCountingKit-8CCK-8可以應(yīng)用于細胞增殖和細胞生長抑制檢測,、毒性測定,、藥物篩選、腫瘤藥敏等試驗,。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運輸,。4℃避光保存，有效期12個月,。-20℃避光保存,，有效期24個月。

04/產(chǎn)品特點

　　即用型試劑,，無須再進行任何試劑的配制

　　對細胞無明顯毒性,，檢測時間更加靈活，可在不同時間點反復(fù)/連續(xù)讀值

　　顯色穩(wěn)定,，使實驗結(jié)果更加可靠

　　線性范圍寬,，靈敏度高

　　可用于大批量樣品的檢測

05/實驗流程概要

06/實驗步驟

一.制作標準曲線（使用此標準曲線的前提條件是試驗條件*一致）

　　1.先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液的細胞數(shù)量，然后接種細胞,；

　　2.按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,，一般需要做5-7個細胞濃度梯度，每組4-6個復(fù)孔,；

　　3.接種后培養(yǎng)4-6小時使細胞貼壁（懸浮細胞可省略此步驟）,；

　　4.加入LeapWal Cell Counting Kit-8試劑（每100μL培養(yǎng)基加10μLCCK-8）。培養(yǎng)一定時間（0.5-4小時）后測定OD450,，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標,，OD450為縱坐標的標準曲線，根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量,。

二.細胞活性檢測

　　1.在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）,，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)16-24小時；

　　2.向每孔中加入10μLCCK-8溶液,，切勿產(chǎn)生氣泡,，氣泡會影響OD值的讀數(shù)；

　　3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4小時,；

　　4.用酶標儀測定450nm處的吸光度,。

三.細胞增殖-毒性檢測

　　1.在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）,，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)16-24小時；

　　2.向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物（依據(jù)實驗者具體方案而定）,；

　　3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一段時間（依據(jù)實驗者具體方案而定）,；

　　4.向每孔加入10μLCCK-8溶液，切勿產(chǎn)生氣泡,，氣泡會影響OD值的讀數(shù),；

　　5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4小時；

　　6.用酶標儀測定450nm處的吸光度,。

　　Ø如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性,，可在加入CCK-8之前，棄去舊培養(yǎng)基,，用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基，來去除藥物的影響,。當藥物影響較小時,，也可以不更換培養(yǎng)基,，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白對照孔的吸光度值即可,。

07/計算公式

　　細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

　　抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

　　As:實驗孔吸光度（含細胞、培養(yǎng)基,、CCK-8溶液和藥物溶液）

　　Ac:對照孔吸光度（含細胞,、培養(yǎng)基、CCK-8溶液,，不含藥物）

　　Ab:空白孔吸光度（含培養(yǎng)基,、CCK-8溶液，不含細胞,、藥物）

08/適用范圍

　　1.細胞增殖測定：CCK-8是水溶性的,，在培養(yǎng)基中穩(wěn)定且無毒。

　　2.細胞活性和細胞毒性分析：代謝活性以及染料的形成與細胞的活性和損傷成比例,。

　　3.細胞因子分析：測定細胞因子誘導(dǎo)的增殖,，必要時，可在試驗結(jié)束時回收和擴增細胞,。

09/注意事項

　　1.使用96孔板進行檢測時,，需考慮液體蒸發(fā)問題。由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā),，建議棄用周圍一圈,，改加等量的PBS、水或培養(yǎng)液,。

　　2.細胞增殖實驗建議每孔加入100μL2000個細胞,，細胞毒性實驗每孔加入100μL5000個細胞（具體每孔所用的細胞數(shù)目,，需根據(jù)細胞大小、細胞增殖速度等因素決定）,。按照實驗需要進行培養(yǎng)并給予0-10μL特定的藥物刺激,。

　　3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，還原劑（例如,，抗氧化劑）會干擾檢測結(jié)果,，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除,。

　　4.測試藥物如含有金屬,，對CCK-8顯色會有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛,、氯化鐵,、硫酸銅會抑制5%，15%,，90%的顯色反應(yīng),，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM,，將會*抑制,，需設(shè)法去除。

　　5.培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結(jié)果,，酚紅的吸光度可以在計算時通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,，因此不會對檢測造成影響。

　　6.檢測時,，如果起始培養(yǎng)體積為100μL,，每孔加入10μLCCK-8溶液。如果起始培養(yǎng)體積為200μL,，則需加入20μLCCK-8溶液,，其它情況以此類推?？梢杂眉恿讼鄳?yīng)量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照,。如果擔(dān)心所使用的藥物會干擾檢測，需設(shè)置加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液,、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照,。

　　7.CCK-8的培養(yǎng)時間一般為0.5-4小時，對于大多數(shù)情況孵育1小時即可,。孵育時間的長短需根據(jù)細胞類型和細胞密度等實驗情況而定,，需要摸索條件，初次實驗時可以在0.5,、1,、2和4小時后分別用酶標儀檢測,，然后選取吸光度范圍比較適宜的時間點用于后續(xù)實驗。

　　8.在450nm測定吸光度,。如無450nm濾光片,，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長,，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定,。

　　9.酶標儀檢測前需確?？變?nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定結(jié)果,。

　　10.需要測定細胞的具體數(shù)量時,，建議同時做標準曲線。

　　11.若檢測樣本較多,，建議采用多通道移液器,，以減小工作量及平行孔間的差異。

　　12.以下方法可以終止CCK-8反應(yīng)(96孔板):(a)顯色反應(yīng)后,，將培養(yǎng)板放置于4℃冰箱內(nèi),。(b)每孔加入10μL0.1MHCl溶液。(c)每孔加入10μL1%(w/v)SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液,。注意：反應(yīng)停止后,，應(yīng)在24小時內(nèi)測定。

　　13.為了您的健康安全,，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗,。

　　14.本產(chǎn)品僅供科研使用,，請勿用于臨床診斷及治療。

10/實驗案例分析

　　1.將不同數(shù)量的HeLa細胞按照每孔100μL培養(yǎng)液接種于96孔板中,，培養(yǎng)24小時后細胞充分貼壁,，每孔加入10μLCCK-8溶液。

　　2.孵育1小時后測定450nm的吸光度值,，檢測結(jié)果如圖3所示,。（檢測結(jié)果僅供參考，實測數(shù)據(jù)會因檢測儀器等的不同而存在差異）

圖3: CCK-8 試劑盒檢測細胞活性