PolyShooter^TM INTERFERE

Transfection Reagent

For the transfection of siRNA/miRNA into animal cells

Catalog Number：P09410

01/產(chǎn)品概述

　　RNA干擾（RNAinterference,，RNAi）是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域十分重大的發(fā)現(xiàn)之一，它是指小分子雙鏈RNA可以特異性地降解同源mRNA,，從而抑制或關(guān)閉特定基因表達的現(xiàn)象。人們只要知道了某種疾病的致病基因，就可以設(shè)計出針對該基因mRNA的小分子干擾RNA（SmallinterferingRNA，siRNA）,，抑制或封閉該致病基因的表達，從而達到治療疾病的目的,。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤等基因治療領(lǐng)域,。RNAi是目前尤為熱門的生命科學(xué)研究領(lǐng)域,，也是未來有發(fā)展前途的新藥開發(fā)領(lǐng)域。除此之外,，RNAi技術(shù)還可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè),、林業(yè)、畜牧業(yè)和漁業(yè)等多種領(lǐng)域,，進行良種培育,、良種篩選和疾病治療等。

　　 siRNA/miRNA導(dǎo)入有以下幾種方法∶化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù),、電穿孔法,、磷酸鈣共沉淀技術(shù)、顯微注射和載體導(dǎo)入技術(shù),。由于電轉(zhuǎn)的方法對細胞損傷比較大,，一般不建議選擇電轉(zhuǎn)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)是目前最為常用的方法,，化學(xué)轉(zhuǎn)染能否成功的關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)染試劑的選擇。

　　 PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410,，即PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑,，適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的高分子聚合物與siRNA/miRNA帶負電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后,，與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用,，并通過內(nèi)吞作用進入細胞，形成內(nèi)含體,。該轉(zhuǎn)染試劑具有質(zhì)子海綿的作用,，能夠吸收溶酶體中的H+,，質(zhì)子的不斷流入導(dǎo)致復(fù)合體腫脹破裂，從而使外源siRNA或miRNA釋放到細胞質(zhì)中,，實現(xiàn)siRNA/miRNA的細胞轉(zhuǎn)染,。

　　PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410 對多種常見細胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率，具有高效低毒,、操作簡單,、重復(fù)性好等優(yōu)點，適用siRNA/miRNA介導(dǎo)的基因抑制實驗,。其*的配方使其轉(zhuǎn)染后無明顯細胞毒性,，因此無需去除轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基，也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系,。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運輸,。4℃保存，有效期6個月,。-30℃至-10℃保存,，有效期12個月，避免反復(fù)凍融,。

04/產(chǎn)品特點

　　轉(zhuǎn)染效率高——針對廣泛類型的細胞,，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率，基因抑制效果好,，脫靶效應(yīng)低

　　細胞毒性低——作用溫和,，能較好地實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細胞毒性之間的平衡

　　適用范圍廣——可用于多種細胞類型，適合siRNA/miRNA介導(dǎo)的基因抑制實驗

　　操作簡單——簡單快速的實驗方案,，可獲得穩(wěn)定的結(jié)果,，且轉(zhuǎn)染后無需去除復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基

05/適用范圍

　　LeapWal PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑，適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染,。

06/實驗流程概要

07/實驗步驟（以24孔板為例,，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標準）

1: 準備待轉(zhuǎn)染細胞

貼壁細胞：轉(zhuǎn)染前一天，將胰酶消化后的細胞按照每孔0.1-1x10⁵個細胞的量進行鋪板,，使其在轉(zhuǎn)染時密度為30%-40%,。

懸浮細胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前,，在24孔板中進行細胞鋪板,，每500 µL生長培養(yǎng)基中加入0.5-2.5x10⁵個細胞。

Ø 細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率,，待轉(zhuǎn)染細胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài),，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細胞進行轉(zhuǎn)染。

2: 準備PolyShooter^TM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

（1）取1 μL siRNA (20 μM,，DEPC水溶解) 加入到1.5 mL離心管中,，加入2 μL PolyShooter^TM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑與siRNA混合，室溫孵育3分鐘,。

Ø 基因性質(zhì),、細胞類型、siRNA效價,、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周轉(zhuǎn)率等因素均會影響siRNA的轉(zhuǎn)染效率,，建議選取siRNA作用濃度在10-100 nM之間，轉(zhuǎn)染試劑的體積應(yīng)根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進行調(diào)整,，請參見表一,。

（2）往上述混合物中加入100 μL Opti-MEMTM I減血清培養(yǎng)基（無血清無雙抗），輕輕混勻,，在室溫下靜置30分鐘,，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

3: siRNA細胞轉(zhuǎn)染

30分鐘后,，將上述100 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細胞,，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

4. 分析轉(zhuǎn)染細胞的基因干擾效率

轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24-48小時后,，可根據(jù)實際情況用RT-PCR、Western Blot,、ELISA,、熒光檢測法、流式細胞術(shù),、報告基因等檢測基因干擾效果,，或進行后續(xù)功能實驗。

Ø 該轉(zhuǎn)染試劑也適合轉(zhuǎn)染miRNA,，具體操作請參考siRNA的操作流程,。

表一：轉(zhuǎn)染量度標準

08/注意事項

1.核酸質(zhì)量：確保siRNA/miRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理的，高純度的siRNA/miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,。

2.細胞質(zhì)量：細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率,，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細胞進行轉(zhuǎn)染,。

3.細胞密度：建議細胞傳代后12-24h內(nèi),、細胞密度為30%-40%時進行轉(zhuǎn)染。不同的細胞轉(zhuǎn)染實驗,，對細胞密度的要求不盡相同,。在進行不同核酸或不同細胞系的轉(zhuǎn)染時，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外,，在實驗過程中保證相同的接種條件,，確保實驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。

4. siRNA與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對于大多數(shù)細胞系而言,，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中siRNA (μL of 20 μM Stock)與PolyShooter^TM INTERFERE Transfection Reagent (μL) 的比例在1：1至1：3之間,，推薦比例為1:2。想要獲得理想的基因干擾結(jié)果,，需要對這一比例進行優(yōu)化,，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細胞及siRNA選擇適合的轉(zhuǎn)染比例。

5. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent的相容性,。

6. 轉(zhuǎn)染前，確保siRNA/miRNA基因沉默表達不會影響細胞活力,。

7. 您需要設(shè)計針對目的基因的若干siRNA（小干擾RNA）,，并評估其效價。

8. 整個實驗過程使用無RNA酶和無熱原性的材料,，如離心管,、槍頭、緩沖液,。

9. 為了您的健康安全,，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗,。

10. 本產(chǎn)品僅供科研使用,，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

1: 轉(zhuǎn)染前一天,，將穩(wěn)定表達GFP的HeLa細胞接種于24孔板,，使其在轉(zhuǎn)染時密度為30%。

2: 按照每孔計量,，取1μL siRNA(GFP/NC, 20 μM)加入到1.5 mL離心管中,，再加入2 μL PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent與siRNA進行混合，室溫孵育3 min,。

3: 往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM^TM I減血清培養(yǎng)基（不含血清不含雙抗）,，輕輕混勻，在室溫條件下靜置30 min,，形成PolyShooter^TM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物,。

4: 30分鐘后，將上述100 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細胞,，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻,。

5: siRNA轉(zhuǎn)染細胞24小時后,，用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測GFP綠色熒光蛋白干擾效果，實驗結(jié)果如圖2所示,。

6: 說明：此次實驗選擇商業(yè)化的 siRNA轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX作為對照組,，RNAiMAX的具體實驗操作按照其說明書進行。簡單來說：在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL siRNA(GFP, 20 μM),，輕輕混勻,。然后，在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL RNAiMAX,，輕輕混勻,。將稀釋的siRNA與稀釋的RNAiMAX輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘,。將混合物添加到細胞中,，其終體積為600μL。siRNA轉(zhuǎn)染細胞24小時后,，用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測GFP綠色熒光蛋白干擾效果,。

圖2: siRNA轉(zhuǎn)染細胞24 h后，熒光顯微鏡(A)及流式細胞儀(B)檢測GFP干擾效果

10/其他相關(guān)產(chǎn)品