熒光素酶(luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱,。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素,在熒光素氧化的過程中,,會發(fā)出生物熒光,。然后可以通過熒光測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光,。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系,可以靈敏,、高效地檢測基因的表達,,是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法,。
目前,,具有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶(Fireflyluciferase)和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶(Renillaluciferase)。其中螢火蟲熒光素酶作為報告基因反應(yīng)目的基因表達的改變,,腎熒光素酶作為內(nèi)參基因,為實驗提供統(tǒng)一基準線(減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細胞的數(shù)目,,細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對實驗準確性的影響),。
螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下,,催化熒光素氧化,生成氧化熒光素,,同時產(chǎn)生黃綠色光,,波長540-600nm,。
腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍光,波長460-540nm,,一般檢測時選用460nm
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性,把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游,,構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞,,適當(dāng)刺激或處理后裂解細胞,測定熒光素酶活性,。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響,。
由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別,,且在動物體內(nèi)無內(nèi)源性表達,使其雙報告基因系統(tǒng)在基因調(diào)控,、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
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