均采用相同的3L生物反應器配置：補料、灌流和濃縮補料（CFB）,。在所有三種工藝模式中都使用了相同的基礎培養(yǎng)基和補料（feed-a和feed-b）,。
補料批培養(yǎng)
補料批培養(yǎng)數(shù)據(jù)
補料批方式接種密度為0.5或2×106個/mL。在2×106個細胞/mL的條件下使指數(shù)生長期縮短2天,，第8天密度達到峰值,，而不是在0.5×106細胞/mL的接種密度條件下第10天。兩種條件下的峰值細胞密度均在20.2-26.2×106cells/mL范圍內,。0.5×106個細胞/mL接種密度條件下,，最終存活率為92.5±0.9%，2×106個細胞/mL接種密度條件下,，最終存活率為82.4±4.8%,。在早期指數(shù)階段產生有限的抗體。兩種條件下,，從指數(shù)期到穩(wěn)定期的后期,，產品滴度均以每日0.55-0.63g/L的速率增加，表明兩種條件下的生產速率具有可比性,。第14天滴度為5.4±0.1g/L（qP為29.4±2.2pg/cell/day）和6.8±0.2g/L (qP為32.0±2.3pg/cell/day)
生物反應器容量產率計算為最終生物反應器滴度除以培養(yǎng)時間,。2×106細胞/mL接種密度條件下的體積產率（VPR）高于0.5×106細胞/mL接種密度條件下的（0.49±0.01g/L/d vs.0.39±0.01g/L/d)，主要是因為它縮短了初始生長階段的時間,，延長了生產階段。高接種密度條件下,，補料量以葡萄糖水平為基礎,，與細胞密度有關，因此補料量較高,。0.5×106個細胞/mL接種密度條件下,，平均補料量為48%（占生物反應器初始體積的百分比），2×106個細胞/mL接種密度條件下,，平均補料量為52%,。這可能是在2×106個細胞/mL接種密度條件下qP略高的原因。
灌流培養(yǎng)
灌流培養(yǎng)數(shù)據(jù)
整個灌流培養(yǎng)過程中保持>85%的高活力,。在基礎培養(yǎng)基條件下,，平均細胞密度維持在44.0±4.1×106個細胞/mL,，從第8天到第32天的日生產力為0.70±0.04g/L/天。在灌流培養(yǎng)中,，由于產品直接從灌流側收獲,，因此生物反應器的體積生產力計算為灌流滴度×灌流率。到灌流培養(yǎng)結束時,，每日產物收獲率（灌流滴度/生物反應器滴度）仍在80%,。
在基礎培養(yǎng)基+補料條件下，隨著細胞密度的增加,，逐漸加入feed-a作為交換培養(yǎng)基的一部分,，同時總交換培養(yǎng)基保持1vvd。增加總培養(yǎng)基交換中feed-a的含量,，直到第12天達到總培養(yǎng)基交換的10%,，并在剩余的培養(yǎng)時間內保持該水平。隨著補料添加量的增加,，平均細胞密度增加到73.9±5.4×106個細胞/mL,，每日生物反應器體積生產力增加到2.29±0.28g/L/day。與僅在基礎培養(yǎng)基條件下相比,，增加培養(yǎng)基可提高穩(wěn)定細胞密度和滴度,。
總體而言，細胞特異性生產力從16.0±1.2pg/cell/day增加到30.1±2.3pg/cell/day,。結果表明,，在基礎培養(yǎng)基+補料條件下，生物反應器生產率提高了230%,。
濃縮補料批（CFB）
濃縮補料培養(yǎng)數(shù)據(jù)
與灌流過程類似,，對僅基礎培養(yǎng)基條件和基礎+補料條件進行評估。添加額外的補料可提高細胞培養(yǎng)性能和體積生產力,。僅在基礎培養(yǎng)基條件下,，峰值細胞密度達到72.0±9.6×106個細胞/mL，第18天的上清滴度為12.2±0.6g/L,。對于基礎培養(yǎng)基+補料條件,，在培養(yǎng)基交換中評估兩種不同的補料量：條件1使用6%的feed-a和2%的feed-b，條件2使用8%的feed-a和8%的feed-b,。條件1產生的峰值細胞密度為117.4×106個細胞/mL,，第18天的上清滴度為21.4g/L。條件2的峰值細胞密度為83.4×106個/mL,，第18天上清滴度為36.7g/L,。在條件2中，當feed-a和feed-b的添加量增加時,，細胞比生產力顯著提高到45.1pg/cell/day,。獲得的qP與高生產率補料批工藝中報告的水平相似,。雖然基礎培養(yǎng)基+補料條件下的存活率下降速度快于單獨純基礎培養(yǎng)基條件，但最終存活率仍維持50%~70%,。在相同的培養(yǎng)條件下（例如,，僅基礎培養(yǎng)基條件），基于ATF的CFB工藝（50kD）可以產生比灌流（0.2µm）更高的活細胞密度,。
為了比較不同工藝間qP和VPR的差異，當僅使用基礎培養(yǎng)基時,，批培養(yǎng),、灌流和CFB處理的qP范圍為14.7-17.1pg/cell/day。批量培養(yǎng)的VPR僅為0.08g/L/day,，而灌流和CFB工藝由于保持了較高的細胞密度,，VPR在0.68- 0.70 g/L/day之間。補料培養(yǎng)qP提高到29.4~ 32.0 pg/ cells/ day,，VPR達到0.39g/L/day （0.5×106個細胞/mL接種密度）或0.49g/L/day（2×106個細胞/mL接種密度）,，N-1灌流的高接種密度提高了VPR，因為它縮短了生長期的時間,，延長了生產力高的穩(wěn)定期的持續(xù)時間,。然而，在灌流和CFB過程中,，由于細胞密度的顯著差異,，補料批培養(yǎng)的VPR仍然低于基礎條件下的VPR。在灌流培養(yǎng)中添加10%的feed-a,，與僅在基礎條件下相比,，VPR提高了約230%(2.29 g/L/day vs. 0.70 g/L/day)，qP提高了約90%（30.1pg/cell/day vs. 16.0pg/cell/day）,。同樣,，在CFB工藝中，添加不同比例的feed-a和feed-b可將VPR提高至1.19g/L/d（6%feed-a+ 2%feed-b）和2.04g/L/d（8%feed-a+ 8%feed-b）,。
所有工藝均獲得了可接受的電荷變化曲線和聚集水平,。與其他兩種工藝相比，CFB工藝產生了更高水平的HMW和略高的酸性變體,，這主要是由于產品所處的細胞培養(yǎng)環(huán)境。產品在補料批和CFB中的停留時間可達整個培養(yǎng)周期,，其中CFB工藝的停留時間最長,。盡管如此，產生的HMW小于5%,，并且大多數(shù)可以通過純化步驟清除,。
對于傾向于聚集的分子,，需要仔細檢查CFB工藝，以確?？山邮艿漠a品質量屬性,。例如,當CFB工藝延長到29天,在基礎培養(yǎng)基條件下觀察到酸性變異和高分子量的增加，即使產品抗體濃度也大幅增加,。另一方面,即使在相同的高細胞密度環(huán)境和培養(yǎng)基成分相似,灌流培養(yǎng)產生低酸性變異和高分子量低,可能是因為產品的短停留時間在生物反應器(1vvd使用,產品連續(xù)運出生物反應器,，停留時間為3天）?？偟膩碚f,，所有的工藝模式和培養(yǎng)基條件都產生了可接受的電荷變化和聚集曲線。
當只使用基礎培養(yǎng)基時,，每克抗體的培養(yǎng)基成本在補料批和灌流過程中都很高,。當在補料批和灌流過程中使用適量的補料時，可以降低每克mAb培養(yǎng)基成本,。盡管補料比基礎培養(yǎng)基貴,，但細胞密度和qP的增加比培養(yǎng)基成本的增加更為顯著。N-1灌流補料的培養(yǎng)基成本低于正常補料批,，這是由于在N-1灌流過程中,，只需3倍的基礎培養(yǎng)基交換即可獲得高接種密度，并且滴度的增加超過了培養(yǎng)基使用量的增加,。兩種條件下,，N-1灌流和灌流（基礎培養(yǎng)基+10%feed-a）的補料批的培養(yǎng)基成本相當，約為10美元/gmAb,。在灌流培養(yǎng)中需要3vvd的灌流率才能保持60×106個細胞/mL的細胞密度,，并且預計1vvd的改進過程可以保持相同的細胞密度，從而使灌流工藝在CoGs（costof goods）方面有利,。
CFB的培養(yǎng)基成本不符合其他工藝模式的趨勢,。在基礎培養(yǎng)基條件下，成本（17.5美元/gmAb）與批培養(yǎng)和灌流工藝相當,。與補料批和灌流不同,，在CFB工藝中使用補料液時，培養(yǎng)基成本實際上增加了,。例如,，當使用補料條件1時，成本增加到19.6美元/gmAb,。在這種特殊情況下,，生物反應器生產率的提高不足以彌補與所使用的補料培養(yǎng)基相關的高成本。在補料條件1下,，邊際細胞比生產力由17.1±1.3pg/cell/day提高到20.1pg/cell/day,。隨著條件2補料量的進一步增加,，qP和VPR均顯著提高。結果,，培養(yǎng)基成本降至17.0美元/gmAb,，僅略低于基礎條件下17.5美元/gmAb的培養(yǎng)基成本。與CFB工藝相關的高培養(yǎng)基成本主要是由于需要相當長的細胞生長時間,。直到培養(yǎng)第10天細胞密度達到峰值水平時,，滴度才顯著增加。因此,，盡管在補料條件2下,，CFB工藝的qP和日生產率很高，但每gmAb的培養(yǎng)基成本遠高于補料批和灌流工藝的10美元/gmAb,。對于CFB工藝,，降低培養(yǎng)基成本的一種方法是延長批次長度，提高使用壽命,；然而,，這必須仔細檢查，因為在生物反應器中停留時間較長可能會影響產品質量屬性,。當CFB延長到更長的持續(xù)時間時,，已經觀察到酸性變體和HMW的增加。
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