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MesenPlify™ 干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基技術(shù)資料（第四期）
本期主要內(nèi)容是分享冷凍保存后的hMSCs的如何復(fù)蘇,，hMSCs的傳代培養(yǎng)具體的操作流程,，成功復(fù)蘇后操作傳代培養(yǎng),，將hMSCs適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基,，獲得最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),。
hMSCs復(fù)蘇傳代培養(yǎng)操作過(guò)程
冷凍保存的hMSCs的復(fù)蘇
1,、將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基提前恢復(fù)至室溫或37°C。
2,、將hMSCs凍存管放置在37°C的水浴中迅速解凍,，直到觀察到剩余的少量冰晶即將消失。
3,、將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)15或50mL錐形管中,，緩慢地滴加10mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基,，輕柔混勻。
4,、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘收集細(xì)胞,。 5、棄去上清液以去除二甲基亞砜(DMSO)保護(hù)劑,。
6,、用1mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。
7,、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。
（注意：如果細(xì)胞密度超過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器的推薦范圍，可能需要在培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋樣品,。）
8,、按照較高的接種密度（5,000-7,000/cm2）將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)容器中，使用MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基補(bǔ)充至適當(dāng)體積,。
（TIPS：當(dāng)細(xì)胞剛從凍存中復(fù)蘇時(shí),，建議使用高的接種密度）
9、在37°C,、5% CO?和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞,。
10、每隔3-4天使用預(yù)熱至37°C的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基進(jìn)行換液,，或傳代（當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時(shí),，具體操作步驟可參考下文“hMSCs的傳代培養(yǎng)"）。
hMSCs的傳代培養(yǎng)
1,、檢查hMSCs是否達(dá)到70-80%的匯合度,。注意不要讓hMSCs達(dá)到100%的匯合度，否則細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)分化的跡象,。
2,、將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基提前恢復(fù)至室溫或37°C。
3,、用10mL的不含Ca++,、不含Mg++的DPBS（不包含在套裝中）輕輕洗滌細(xì)胞一次。
4,、添加復(fù)溫的0.125%胰蛋白酶消化液（稀釋為0.5x使用）或重組胰蛋白酶消化液TrypLE（1×）（不包含在套裝中）,，以覆蓋整個(gè)組織培養(yǎng)瓶的表面。
5,、輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，使胰蛋白酶均勻分布在表面上。
6,、放在37°C培養(yǎng)箱中2-7分鐘,。 （TIPS：初次使用 MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基應(yīng)摸索合適的消化時(shí)間,，若細(xì)胞剛從FBS培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，可能需要5-7分鐘,。若細(xì)胞已適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng),，消化時(shí)間可能縮短至2-4分鐘。 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中較容易消化脫落,，此為正?，F(xiàn)象，應(yīng)注意避免消化過(guò)度的情況發(fā)生,，推薦使用重組胰蛋白酶消化液 TrypLE（1×）,，若采用胰蛋白酶消化液，可稀釋到 0.125%（0.5x）使用）,。
7,、使用相差顯微鏡檢查細(xì)胞是否已脫落，輕輕敲擊培養(yǎng)瓶的側(cè)面以幫助脫落,。
8,、一旦細(xì)胞脫落并自由漂浮，將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基添加到消化液體積的3倍,，以終止消化。
9,、將細(xì)胞懸液收集到一個(gè)50mL錐形管中,。
10、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘,。
11,、棄去上清液以去除胰蛋白酶。
12,、用1mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞,。
13、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。（TIPS：如果細(xì)胞密度超過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器的推薦范圍,，可能需要在培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋樣品。）
14,、計(jì)算所需的培養(yǎng)基體積,，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要或視細(xì)胞狀態(tài)，以常規(guī)的接種密度（3000-5000/cm2）或較高接種密度（5000-7000/cm2）將細(xì)胞接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中,。
15,、使用MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基補(bǔ)充至適當(dāng)體積（可參考下表）。
16,、在37°C,、5% CO?和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞,。
17、每隔3-4天使用預(yù)熱至37°C的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基進(jìn)行換液,，或傳代（當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時(shí)）,。
hMSC傳代和培養(yǎng)操作推薦用量:
hMSCs的冷凍保存
1、通過(guò)添加20%二甲基亞砜（DMSO,，套裝中未提供）制備2x的冷凍保存液,。
（TIPS：假設(shè)最終需要的細(xì)胞凍存體積為1mL，先準(zhǔn)備500uL的2x冷凍保存液,，配制方法是將100uL的100% DMSO加入到400uL的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基中）
2,、將細(xì)胞復(fù)溫至室溫的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基中懸浮，使細(xì)胞的濃度為常規(guī)細(xì)胞濃度的兩倍（例如2x106/mL）,。
3,、將步驟1中制備的2x冷凍保存液，以1:1的體積,，緩慢地滴加到細(xì)胞懸浮液中,，然后用移液管輕輕混合。（此時(shí),，冷凍液的濃度被稀釋為1x,，即DMSO的最終濃度為10%，細(xì)胞濃度為1x106/mL）
4,、將混合好的細(xì)胞懸液,，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷到2- 8°C的細(xì)胞凍存管中。
5,、轉(zhuǎn)入梯度降溫盒,，-80℃過(guò)夜，隔天轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存,。
（TIPS：也可以購(gòu)買其他商品化的hMSCs冷凍保存液進(jìn)行凍存,，操作步驟參見(jiàn)其說(shuō)明書進(jìn)行）
hMSC的特性分析
可以使用流式細(xì)胞術(shù)、集落形成單位（CFU）分析以及多向分化分析對(duì)培養(yǎng)的hMSCs進(jìn)行特性分析,。 詳情請(qǐng)參考指南手冊(cè)獲取信息(Guide Book: Human Mesenchymal Stem Cells),。
將hMSC適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基的過(guò)程
如果正在使用其他品牌培養(yǎng)基，可以直接切換到MesenPlifyTM sXF體系,，一般情況下無(wú)需進(jìn)行預(yù)處理,。當(dāng)細(xì)胞剛從凍存中復(fù)蘇時(shí)，也可先用原培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇,，隨后在Day1更換為MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基,，后續(xù)即可正常使用MesenPlifyTM sXF基培養(yǎng)或傳代
將hMSC適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基的過(guò)程
僅供研究使用（RUO），或用于進(jìn)一步制造。
不適用于人類或動(dòng)物診斷或治療用途,。
產(chǎn)品按照ISO 13408和ISO 9001相關(guān)的質(zhì)量管理體系進(jìn)行制造,。
對(duì)本產(chǎn)品感興趣的老師~
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