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MesenPlify™ 干細胞擴增培養(yǎng)基技術(shù)資料（第四期）
本期主要內(nèi)容是分享冷凍保存后的hMSCs的如何復蘇,，hMSCs的傳代培養(yǎng)具體的操作流程,，成功復蘇后操作傳代培養(yǎng),，將hMSCs適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基,，獲得最終實驗數(shù)據(jù),。
hMSCs復蘇傳代培養(yǎng)操作過程
冷凍保存的hMSCs的復蘇
1,、將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基提前恢復至室溫或37°C。
2,、將hMSCs凍存管放置在37°C的水浴中迅速解凍,，直到觀察到剩余的少量冰晶即將消失。
3,、將凍存管內(nèi)的細胞懸液轉(zhuǎn)移到一個15或50mL錐形管中,，緩慢地滴加10mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基，輕柔混勻,。
4,、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘收集細胞。 5,、棄去上清液以去除二甲基亞砜(DMSO)保護劑,。
6、用1mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基重新懸浮細胞,。
7,、進行細胞計數(shù)。
（注意：如果細胞密度超過細胞計數(shù)器的推薦范圍,，可能需要在培養(yǎng)基中進一步稀釋樣品,。）
8、按照較高的接種密度（5,000-7,000/cm2）將細胞接種到細胞培養(yǎng)容器中,，使用MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基補充至適當體積,。
（TIPS：當細胞剛從凍存中復蘇時，建議使用高的接種密度）
9,、在37°C,、5% CO?和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。
10,、每隔3-4天使用預(yù)熱至37°C的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基進行換液,，或傳代（當細胞匯合度達到70-80%時，具體操作步驟可參考下文“hMSCs的傳代培養(yǎng)"）。
hMSCs的傳代培養(yǎng)
1,、檢查hMSCs是否達到70-80%的匯合度,。注意不要讓hMSCs達到100%的匯合度，否則細胞可能會出現(xiàn)分化的跡象,。
2,、將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基提前恢復至室溫或37°C。
3,、用10mL的不含Ca++,、不含Mg++的DPBS（不包含在套裝中）輕輕洗滌細胞一次。
4,、添加復溫的0.125%胰蛋白酶消化液（稀釋為0.5x使用）或重組胰蛋白酶消化液TrypLE（1×）（不包含在套裝中）,，以覆蓋整個組織培養(yǎng)瓶的表面。
5,、輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，使胰蛋白酶均勻分布在表面上。
6,、放在37°C培養(yǎng)箱中2-7分鐘,。 （TIPS：初次使用 MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基應(yīng)摸索合適的消化時間，若細胞剛從FBS培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)過來,，可能需要5-7分鐘,。若細胞已適應(yīng)無血清培養(yǎng)，消化時間可能縮短至2-4分鐘,。 細胞在無血清培養(yǎng)基中較容易消化脫落,，此為正常現(xiàn)象,，應(yīng)注意避免消化過度的情況發(fā)生,，推薦使用重組胰蛋白酶消化液 TrypLE（1×），若采用胰蛋白酶消化液,，可稀釋到 0.125%（0.5x）使用）,。
7、使用相差顯微鏡檢查細胞是否已脫落,，輕輕敲擊培養(yǎng)瓶的側(cè)面以幫助脫落,。
8、一旦細胞脫落并自由漂浮,，將MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基添加到消化液體積的3倍,，以終止消化。
9,、將細胞懸液收集到一個50mL錐形管中,。
10,、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘。
11,、棄去上清液以去除胰蛋白酶,。
12、用1mL MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基重新懸浮細胞,。
13,、進行細胞計數(shù)。（TIPS：如果細胞密度超過細胞計數(shù)器的推薦范圍,，可能需要在培養(yǎng)基中進一步稀釋樣品,。）
14、計算所需的培養(yǎng)基體積,，根據(jù)實驗需要或視細胞狀態(tài)，以常規(guī)的接種密度（3000-5000/cm2）或較高接種密度（5000-7000/cm2）將細胞接種到新的細胞培養(yǎng)器皿中,。
15,、使用MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基補充至適當體積（可參考下表）。
16,、在37°C,、5% CO?和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。
17,、每隔3-4天使用預(yù)熱至37°C的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基進行換液,，或傳代（當細胞匯合度達到70-80%時）。
hMSC傳代和培養(yǎng)操作推薦用量:
hMSCs的冷凍保存
1,、通過添加20%二甲基亞砜（DMSO,，套裝中未提供）制備2x的冷凍保存液。
（TIPS：假設(shè)最終需要的細胞凍存體積為1mL,，先準備500uL的2x冷凍保存液,，配制方法是將100uL的100% DMSO加入到400uL的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基中）
2、將細胞復溫至室溫的MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基中懸浮,，使細胞的濃度為常規(guī)細胞濃度的兩倍（例如2x106/mL）,。
3、將步驟1中制備的2x冷凍保存液,，以1:1的體積,，緩慢地滴加到細胞懸浮液中，然后用移液管輕輕混合,。（此時,，冷凍液的濃度被稀釋為1x，即DMSO的最終濃度為10%,，細胞濃度為1x106/mL）
4,、將混合好的細胞懸液,，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷到2- 8°C的細胞凍存管中。
5,、轉(zhuǎn)入梯度降溫盒,，-80℃過夜，隔天轉(zhuǎn)入液氮長期保存,。
（TIPS：也可以購買其他商品化的hMSCs冷凍保存液進行凍存,，操作步驟參見其說明書進行）
hMSC的特性分析
可以使用流式細胞術(shù)、集落形成單位（CFU）分析以及多向分化分析對培養(yǎng)的hMSCs進行特性分析,。 詳情請參考指南手冊獲取信息(Guide Book: Human Mesenchymal Stem Cells),。
將hMSC適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基的過程
如果正在使用其他品牌培養(yǎng)基，可以直接切換到MesenPlifyTM sXF體系,，一般情況下無需進行預(yù)處理,。當細胞剛從凍存中復蘇時，也可先用原培養(yǎng)基進行復蘇,，隨后在Day1更換為MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基,，后續(xù)即可正常使用MesenPlifyTM sXF基培養(yǎng)或傳代
將hMSC適應(yīng)到MesenPlifyTM sXF培養(yǎng)基的過程
僅供研究使用（RUO），或用于進一步制造,。
不適用于人類或動物診斷或治療用途,。
產(chǎn)品按照ISO 13408和ISO 9001相關(guān)的質(zhì)量管理體系進行制造。
對本產(chǎn)品感興趣的老師~
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