2009年,，Hans Clevers及其團(tuán)隊(duì)成功利用小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出了第一個(gè)腸道類器官，從而揭開(kāi)了類器官研究的新篇章,。類器官的培養(yǎng)過(guò)程涉及成體干細(xì)胞（TSCs）或多能干細(xì)胞（PSCs）在體外進(jìn)行3D培養(yǎng),，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織模擬物，其結(jié)構(gòu)和功能類似于真實(shí)器官,，這有助于提高藥物研發(fā)的成功率,。未來(lái)借助AI技術(shù)與類器官的聯(lián)合應(yīng)用，藥物篩選將變得更為高效和精準(zhǔn),。

人類大腦發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而精密的過(guò)程,，不僅與神經(jīng)祖細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)張有關(guān)，還需要同時(shí)建立一個(gè)多細(xì)胞組織結(jié)構(gòu),。理論上,，不斷擴(kuò)大的類器官可以直接從多個(gè)體組織細(xì)胞中生長(zhǎng)，但到目前為止,，腦類器官只能從多能干細(xì)胞中建立,。2024年1月，類器官*Hans Clevers教授與Benedetta Artegian教授團(tuán)隊(duì)在CELL上聯(lián)合發(fā)表了“Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids"一文,。該研究直接從人胎兒腦組織中培育出體外自組織的大腦類器官,，命名為FeBOs（Fetal brain in vitro self-organizes into organoids）。這種實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的類器官不僅創(chuàng)立了研究大腦發(fā)育的全新模式,，還為深入探討大腦發(fā)育相關(guān)疾病,，如腦腫瘤的發(fā)展和治療，提供了有價(jià)值的新途徑,。

首先,，研究人員從人類胎兒腦組織中分離出神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs），這些細(xì)胞以單層或3D細(xì)胞聚集物的形式生長(zhǎng),；同時(shí),，若將組織切成小塊，并在無(wú)血清和無(wú)細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，也能形成有組織的3D結(jié)構(gòu),，稱之為胎兒衍生腦類器官（FeBOs）,。超過(guò)95%的FeBOs系可通過(guò)切割整個(gè)類器官樣體進(jìn)行傳代，每個(gè)切割片段都能重新形成完整的類器官樣體,，提高了FeBOs系的可重復(fù)性,，為下游應(yīng)用提供了穩(wěn)定的擴(kuò)增。隨后,，研究人員利用標(biāo)志基因評(píng)估FeBOs的細(xì)胞組成,，發(fā)現(xiàn)外圍富含神經(jīng)干/祖細(xì)胞（SOX2⁺），而中心則分布神經(jīng)元細(xì)胞（TUJ1⁺, DCX⁺, NeuN⁺）,。細(xì)胞組成定量分析顯示，F(xiàn)eBOs內(nèi)細(xì)胞的可再生豐度和異質(zhì)性,。通過(guò)慢病毒感染完整的FeBOs,，研究人員評(píng)估了細(xì)胞系動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加,，支持正在進(jìn)行的神經(jīng)發(fā)生,。此外，轉(zhuǎn)錄組分析還揭示了FeBOs的神經(jīng)外胚層特征,。

圖1 人胎兒腦自組織類器官的建立

為研究是否能夠培養(yǎng)具有人腦區(qū)域特異性的FeBOs,，檢驗(yàn)其在體外是否能保持內(nèi)在組織特性，研究團(tuán)隊(duì)成功建立了背側(cè)和腹側(cè)FeBOs系,，并通過(guò)qPCR檢測(cè)標(biāo)志物的表達(dá),。隨后，免疫熒光表征進(jìn)一步顯示了FeBOs的區(qū)域特異性,，同時(shí)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析也進(jìn)一步揭示了FeBOs與人胎兒腦組織細(xì)胞的相似性,。

圖2 FeBOs與人胎兒腦組織的細(xì)胞相似性

越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和ECM-細(xì)胞相互作用在調(diào)節(jié)人類大腦發(fā)育中的特異性擴(kuò)張方面起著至關(guān)重要的作用,。通過(guò)與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)比較,，他們發(fā)現(xiàn)大腦ECM關(guān)鍵成分在轉(zhuǎn)錄組-蛋白質(zhì)組表達(dá)上呈現(xiàn)出良好的一致性。分泌蛋白組的結(jié)果顯示,，持續(xù)的組織完整性有助于生成ECM生態(tài)位,，而ECM生態(tài)位可能反過(guò)來(lái)促進(jìn)FeBOs在組織結(jié)構(gòu)中的持續(xù)擴(kuò)張，使研究人類大腦發(fā)育中的功能性ECM成為可能,。

鑒于來(lái)源于組織的類器官具備迅速擴(kuò)張的潛力,，研究團(tuán)隊(duì)深入研究了這些類器官在模擬腦癌方面的潛能。在本文中,，研究團(tuán)隊(duì)利用NEPA21成功將piggyBac質(zhì)粒,、CAG-EGFP質(zhì)粒、sgRNA質(zhì)粒和mCherry-Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胎兒腦類器官中,，實(shí)現(xiàn)了FeBOs的熒光標(biāo)記和基因編輯,。結(jié)果顯示,，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的培養(yǎng)，具有TP53基因缺陷的細(xì)胞數(shù)量超過(guò)了類器官中的健康細(xì)胞,，表明該FeBOs突變株具備癌細(xì)胞異常增殖的特性,。這一研究提供了先進(jìn)的類器官模型，為深入了解大腦發(fā)育和相關(guān)疾病提供有力工具,，對(duì)神經(jīng)科學(xué)研究和疾病治療具有重要,。

圖3 FeBOs支持穩(wěn)定的腫瘤建模

值得關(guān)注的是，腫瘤類器官模型的建立依賴于穩(wěn)定,、高效的轉(zhuǎn)染方法,。有報(bào)告指出，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在腸道類器官中的轉(zhuǎn)染效率不足10%,。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高,，但是病毒隨機(jī)整合到宿主中具有潛在的誘變性。電穿孔法不僅可以實(shí)現(xiàn)類器官60%或更高的轉(zhuǎn)染效率,，同時(shí)也具備更高的生物安全性,。

NEPA21電轉(zhuǎn)染儀是由日本NEPAGENE品牌推出的一款先進(jìn)的電穿孔設(shè)備，其四步法電轉(zhuǎn)程序極大地提升了類器官轉(zhuǎn)染的效率,，使其成為類器官轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的解決方案,。自2015年起，Hans Clevers教授及其合作團(tuán)隊(duì)便使用NEPA21進(jìn)行類器官轉(zhuǎn)染,，至今已經(jīng)在腸道,、肝臟、乳腺組織,、子宮內(nèi)膜和大腦等多種組織類器官中成功實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)染及編輯,。

NEPA21電穿孔類器官體系及參數(shù)總結(jié)如下：

人胎兒腦類器官

人乳腺組織類器官

人胎兒肝臟類器官

人腸道類器官

圖4 類器官電穿孔基本流程

了解更多類器官電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作及參數(shù)設(shè)置或查閱NEPAGENE類器官應(yīng)用文獻(xiàn)：

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序，配合電壓衰減設(shè)計(jì),，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí),，提高細(xì)胞存活率。操作簡(jiǎn)單,，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見(jiàn)可調(diào),，適用性強(qiáng)。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞,、干細(xì)胞,、神經(jīng)細(xì)胞、外泌體,、類器官,、活體動(dòng)物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染,，已應(yīng)用于眾多著名期刊文獻(xiàn)中,，是進(jìn)行細(xì)胞懸浮/貼壁狀態(tài),、活體和離體組織轉(zhuǎn)染的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)主流品牌之一。

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