伴隨著免疫學(xué),、細胞生物學(xué)和病毒學(xué)等學(xué)科的發(fā)展以及細胞制造和基因工程技術(shù)的進步使得免疫細胞治療各疾病的研究取得了令人振奮的進展,，該進展也使免疫細胞療法從研究機構(gòu)小規(guī)模研究的治療方法一躍成為全球企業(yè)開發(fā)的焦點?；蚬こ毯团R床規(guī)模的基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展以及相關(guān)藥企的投資,，使免疫細胞療法在當(dāng)今以及未來幾十年內(nèi)對人類健康產(chǎn)生重大的影響。免疫細胞療法利用患者自身的免疫系統(tǒng)對抗疾病,，而免疫細胞(如T細胞,、B細胞、NK細胞,、巨噬細胞等)的基因工程改造是免疫細胞療法的先決條件,。例如在CAR-T治療中，患者的T細胞在體外被進行基因改造表達腫瘤相關(guān)抗原受體，從而使CAR-T細胞能夠在患者體內(nèi)靶向殺傷特定的癌細胞,。

免疫細胞基因編輯技術(shù)的關(guān)鍵步驟是需要將細胞外源物質(zhì)（DNA\RNA\RNP等）導(dǎo)入到細胞內(nèi)從而實現(xiàn)相關(guān)的基因編輯,，然而目前該技術(shù)的挑戰(zhàn)在于使用傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染方法存在傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染方法存在引起宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致療效降低以及生物安全等問題，而電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)具備無毒性,、效率高等特點繞過了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法的潛在缺陷,，因此電轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。做為在細胞轉(zhuǎn)染和融合領(lǐng)域擁有超過二十年的研究經(jīng)驗的NEPA GENE公司來說,，其代表產(chǎn)品NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)自上市以來備受國內(nèi)外眾多用戶的青睞,。在免疫細胞轉(zhuǎn)染方面，NEPA21均被研究者們用于轉(zhuǎn)染實驗中,，積累了豐富的轉(zhuǎn)染條件,、產(chǎn)品應(yīng)用等寶貴的經(jīng)驗和數(shù)據(jù)。以下列舉的是近年來科研人員使用NEPA21在免疫細胞轉(zhuǎn)染的部分案例：

案例1 使用NEPA21電轉(zhuǎn)人NK細胞

參考文獻：Ng Y Y, Du Z, Zhang X, et al. CXCR4 and anti-BCMA CAR co-modified natural killer cells suppress multiple myeloma progression in a xenograft mouse model[J]. Cancer Gene Therapy, 2022.

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：CXCR4 mRNA

電轉(zhuǎn)參數(shù)：穿孔電壓240V,脈沖長度2ms,，脈沖次數(shù)1次

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma, MM）是一種以骨髓漿細胞克隆擴增和免疫球蛋白異常積聚為特征的B細胞腫瘤,，以溶解性骨病為標志。近年來,，嵌合抗原受體（CAR）細胞療法已成為一種新的治療MM的方法,，而在CAR細胞治療MM的潛在靶點中，B細胞成熟抗原（BCMA）是一個理想的靶點,。目前的BCMA特異性CAR細胞療法使用來自患者的自體T細胞或NK細胞,，而NK細胞轉(zhuǎn)運到骨髓依賴于CXCR4的表達，CXCR4是一種趨化因子受體,，與骨髓表達小眾的趨化因子CXCL12/SDF-1α結(jié)合,。

基于此，在該研究中為了產(chǎn)生表達CXCR4的NK細胞,，將0.2ml的擴增后的10⁷個NK細胞與10μg CXCR4 mRNA混合,，使用NEPA21電轉(zhuǎn)儀在2mm電轉(zhuǎn)杯中進行電轉(zhuǎn)染，下游實驗電轉(zhuǎn)染方法也被用于在NK細胞上表達抗BCMA CAR受體,。電轉(zhuǎn)染后檢測檢測CXCR4分子的表達情況,，結(jié)果顯示：模擬NK細胞和經(jīng)CXCR4WT RNA電穿孔的NK細胞在細胞遷移方面無顯著差異（P=0.159，圖1C）,。進一步證明,，CXCR4R334X mRNA和CXCR4WT mRNA的電穿孔不影響NK細胞的細胞溶解功能，并且兩種類型的CXCR4修飾的NK細胞能夠像模擬電穿孔的NK細胞一樣有效地溶解K562細胞（圖1D）,。接下來,，作者也測試了CXCR4r334x修飾的NK細胞會更有效地遷移到NSG小鼠的骨髓腔室（圖1E）。結(jié)論是體外擴增NK細胞中CXCR4的過表達可有效促進其向骨髓遷移,。

圖1.通過mRNA電穿孔過表達CXCR4R334X可提高NK細胞的遷移和歸巢能力（A:在NK細胞體外擴增前后,，用CXCR4WT mRNA或CXCR4R334X mRNA電穿孔（電穿孔后8h）后，分析CXCR4在NK細胞中的表達D:轉(zhuǎn)染mRNA的NK細胞對K562細胞株的細胞毒性實驗,，證明電穿孔對NK細胞的細胞毒性沒有影響,。

在后續(xù)電轉(zhuǎn)實驗中，作者提到電轉(zhuǎn)后NK細胞的活力70-80%,，其中約90%的NK細胞被轉(zhuǎn)染以表達CARs（圖2）,。

圖2.電轉(zhuǎn)后,，NK細胞的存活率為70—80%,，轉(zhuǎn)染效率為90%

案例2基于CRISPR/cas9的基因編輯法使用NEPA21電轉(zhuǎn)染人的T細胞

參考文獻：Ito Y, Inoue S, Nakashima T, et al. Epigenetic profiles guide improved CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in human T cells[J]. Nucleic acids research, 2024.

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：RNP復(fù)合物

電轉(zhuǎn)參數(shù)：穿孔脈沖：電壓275V，脈沖時長1ms,，脈沖間隔50ms,，脈沖2次，衰減率10%,，極性+,；轉(zhuǎn)移脈沖：電壓20V，脈沖時長50ms,，脈沖間隔50ms,，脈沖5次，衰減率40%,，極性+/-,。

在免疫細胞過繼免疫治療中,，對特定基因進行基因修飾是增強抗腫瘤免疫細胞功能的有效手段,。目前CRISPR/Cas9技術(shù)的進展使得在體外制備輸注的T細胞產(chǎn)品時，可通過瞬時轉(zhuǎn)染RNP實現(xiàn)基因敲除,。然而選擇最佳的gRNAs仍是有效基因敲除的主要挑戰(zhàn),。在本實驗中作者利用人類T細胞中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除的匯總數(shù)據(jù)探索了一種選擇最佳gRNA的方法。作者使用了高通量測序（ATAC-seq）法從轉(zhuǎn)座酶及染色質(zhì)中獲得的培養(yǎng)T細胞的表觀遺傳譜數(shù)據(jù),，將表觀遺傳信息與基于序列的預(yù)測工具相結(jié)合,，顯著提高了基因編輯效率（圖1）。并且進一步證明,，通過在相鄰區(qū)域設(shè)計兩個gRNA,，可以靶向表觀遺傳封閉區(qū)域。該實驗證明了通過IL-7預(yù)處理可以提高未活化T細胞的基因編輯效率,。這些發(fā)現(xiàn)使得在人類T細胞中進行更有效的基因編輯成為可能,。

圖1.基于ATAC-seq與IL-7的預(yù)處理,，顯著提高T細胞的基因編輯效率,。

由于病毒轉(zhuǎn)染方法獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)構(gòu)建了許多用于設(shè)計gRNA的預(yù)測工具,，但尚不確定這些發(fā)現(xiàn)是否適用于電轉(zhuǎn)染RNP的情況。因此在研究CAR-T細胞的基因工程中,，作者利用Cas9-gRNA RNP復(fù)合物的瞬態(tài)電穿孔來增強其功能,，在T細胞激活后5天內(nèi)，使用NEPA 21電穿孔器（NEPA GENE）將核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）進行電穿孔到T細胞中,。48-72h后,，提取基因組DNA,通過PCR擴增含有目標位點的基因組區(qū)域，并將擴增子進行Sanger測序,。使用CRISPR編輯推斷（ICE）分析計算每個gRNA的編輯效率,。使用Indel百分比來評估CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯效率（使用TYE 563標記的RNA去判斷RNP復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果）。采用電轉(zhuǎn)染方法,，作者積累了205個gRNA針對110個基因的Indel百分比數(shù)據(jù),，發(fā)現(xiàn)效率在不同的靶位點之間變化很大（圖2A）。

圖2A.CRISPR/ cas9介導(dǎo)的人類T細胞基因編輯效率的gRNA設(shè)計算法的驗證,分別用Cas9-gRNA復(fù)合物電穿孔T細胞,，分析基因編輯效率（n = 205個靶標）。

采用同樣的電穿孔參數(shù),，將TET2（圖3B）,、DOT1L（圖3D）和PRDM1（圖3F）敲除時可增強T細胞早期記憶表型的維持，并計算Indel百分比,。

圖3.(A)gRNA設(shè)計在兩個近端區(qū)域,；兩個gRNA單獨或聯(lián)合電穿孔TET2 (B),、DOT1L(D)和PRDM1(F)時，計算Indel百分比

為了研究了組成性表達的Cas9和gRNA是否最終能夠切割染色質(zhì)關(guān)閉狀態(tài)的靶位點,，用Cas9和gRNA穩(wěn)定地電轉(zhuǎn)染人T細胞白血病細胞系Jurkat,，這些gRNA靶向9個基因內(nèi)的表觀遺傳封閉區(qū)和2個基因內(nèi)的開放區(qū)作為陽性對照。觀察到Cas9和gRNAs穩(wěn)定表達的Jurkat細胞的Indel百分比逐漸增加,，到第14天達到60 - 100%,。這些結(jié)果表明，組成型表達的Cas9和gRNA基因敲除受封閉表觀遺傳狀態(tài)的阻礙較小,。

接下來作者檢測了IL-7預(yù)培養(yǎng)是否會影響未刺激T細胞的基因編輯效率（圖4A）,。有趣的是，在所有測試基因中,，IL-7處理后,，Indel百分比逐漸提高（圖4B）。這些結(jié)果表明,，IL-7預(yù)處理可以對未受刺激的T細胞進行遺傳修飾,聯(lián)合使用IL-7預(yù)處理和雙gRNA靶向進一步提高了未活化T細胞的基因編輯效率（圖4B）,。增強基因編輯的機制之一可能與RNP復(fù)合物有效進入T細胞有關(guān),。事實上，IL-7預(yù)培養(yǎng)增加了T細胞對熒光染料TYE 563標記的雙工RNA的攝取,，表明轉(zhuǎn)染效率提高,。一般來說，體積小的細胞需要較大的外電場才能實現(xiàn)滲透,。Na?ve經(jīng)過IL-7預(yù)培養(yǎng)后,，T細胞的細胞大小增加，這可能在一定程度上有助于RNP復(fù)合物的高效轉(zhuǎn)染,。

圖4.在未激活的T細胞中，IL-7預(yù)處理可增強基因編輯效率,。(A)電穿孔實驗方案示意圖,。將未激活的T細胞在IL-7的存在下培養(yǎng)，規(guī)定的時間段用Cas9/gRNA電穿孔,，(B)所示數(shù)據(jù)為每種情況下靶向DPH1,、FURIN和SELL的gRNA的估計指數(shù)百分比。

總之,，該研究證明了在選擇最佳的人T細胞CRISPR/Cas9靶點時需考慮表觀遺傳譜的重要性,，結(jié)合ATAC-seq數(shù)據(jù)和可用的預(yù)測工具（利用Cas9/gRNA RNP復(fù)合物電穿孔人類T細胞的數(shù)據(jù)，研究這些工具如何精確地預(yù)測靶向效率）支持鑒定有效的gRNA靶標,。這些發(fā)現(xiàn)為人類T細胞的基因編輯提供了大量有效信息,。

案例3使用NEPA21電轉(zhuǎn)染人、小鼠的B細胞

參考文獻：David K, Friedlander G, Pellegrino B, et al. CD74 as a regulator of transcription in normal B cells[J]. Cell Reports, 2022.

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：siRNA

電轉(zhuǎn)參數(shù)：275V,3ms,。

B淋巴細胞通過分泌抗體和細胞因子,，并通過其抗原呈遞功能啟動T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在體液免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,。CD74是一種II型跨膜蛋白,，主要在抗原呈遞細胞（APC）上表達,，CD74 的配體是巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）細胞因子超家族,，其與CD74 結(jié)合以誘導(dǎo)與CD44 形成復(fù)合物。該受體復(fù)合物對于啟動調(diào)節(jié)B細胞維持所需的信號級聯(lián)反應(yīng)至關(guān)重要并涉及PI3K/AKT通路的激活,。該復(fù)合物被內(nèi)化到內(nèi)吞區(qū)室,，在那里它被切割釋放CD74 細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域片段（CD74-ICD）。CD74-ICD易位至細胞核誘導(dǎo)核因子κB（NF-κB）的p65激活結(jié)構(gòu)域磷酸化,，并與其共激活因子一起上調(diào)TAp63 表達,。該激活通路誘導(dǎo)BCL-2表達水平升高，并導(dǎo)致控制 B 細胞增殖和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,。在之前的研究中,，科學(xué)家已經(jīng)證實了CD74在慢性淋巴細胞白血?。–LL）細胞中起著轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用，但在B細胞中的功能研究還未有過,，因此該研究是很有必要的,。

為了研究CD74在B細胞中的功能作者對來源于人和老鼠的正常B細胞進行RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄、抗CD74抗體活化B細胞,、制備ChIP-seq文庫及其序列分析,、沉淀抗體加到細胞裂解物中進行免疫沉淀分析、siRNA電轉(zhuǎn)染B細胞,、流式細胞染色,、模型構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析等方法（圖1）。

圖1.CD74在健康與CLL患者的B細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用對比,，揭示了在致癌轉(zhuǎn)化過程中激活或抑制的途徑。

其中在電轉(zhuǎn)染實驗過程中,，作者使用NEPA21電穿孔儀通過電穿孔人和小鼠的B細胞引入siRNA（使用的抑制序列包括：人和老鼠細胞的PAX5,；非特異性對照siRNA；圖2H,、圖3A）,。

圖2H.用PAX5或?qū)φ誷iRNA電轉(zhuǎn)染純化的健康人B細胞,，通過qRT-PCR分析DMTF1的mRNA水平,，圖表顯示了所選基因的倍數(shù)變化。

圖3.CD74以PAX5 依賴性方式調(diào)節(jié) DMTF1轉(zhuǎn)錄(A:用siRNA PAX5或siCtrl轉(zhuǎn)染老鼠B細胞,，培養(yǎng)后，用載體活化細胞1小時收集細胞并進ChIP,，CD74-ICD與DMTF1基因的啟動子區(qū)域的結(jié)合由qPCR確定.Graph表示輸入富集百分比,。

在本研究中，作者研究了CD74-ICD在正常B細胞中的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控功能,。發(fā)現(xiàn)激活后CD74-ICD在胞質(zhì)溶膠中與轉(zhuǎn)錄因子（如PAX5）形成復(fù)合物,，并且與CLL細胞中的結(jié)合相比，染色質(zhì)在位點數(shù)量明顯增加,。這些結(jié)合基因主要部分的表達在惡性細胞中被關(guān)閉,。CD74-ICD：PAX5復(fù)合物結(jié)合抑癌基因 DMTF1 的啟動子區(qū)域，并通過抑制轉(zhuǎn)錄下調(diào)其表達,。這些發(fā)現(xiàn)可以幫助確定在致癌轉(zhuǎn)化過程中受到調(diào)節(jié)的新治療途徑,，并成為未來治療的靶點。

總 結(jié)

如今隨著基于細胞的基因治療分子工具被開發(fā)利用，包括FDA批準的CAR-T免疫療法,、iPSC,、細胞重編程和基因編輯等。盡管這些應(yīng)用取得了很好的結(jié)果,，但包括核酸和蛋白質(zhì)在內(nèi)的等外源分子在細胞內(nèi)的遞送仍然具有挑戰(zhàn)性,，因此，以脈沖電場電穿孔細胞基因轉(zhuǎn)移具有明顯的處理簡單,、高效,、高轉(zhuǎn)染、高存活率以及免疫反應(yīng)限制低等優(yōu)勢,，電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)已成為目前流行的非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)之一,。電轉(zhuǎn)染技術(shù)也在由細胞的基因功能紊亂或突變所引發(fā)的諸多疾病（如免疫缺陷病,、癌癥,、帕金森病、阿爾茨海默病等）研究治療中,，通過將質(zhì)?；蛳嚓P(guān)基因編輯分子工具引入到細胞內(nèi)來解讀細胞功能、指導(dǎo)細胞命運,、重編程細胞行為的重要策略,，有望對細胞的正常功能恢復(fù)和疾病的治療做出重要貢獻。

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計的電轉(zhuǎn)程序,，配合電壓衰減設(shè)計,，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時，提高細胞存活率,。操作簡單,，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào)，適用性強,。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細胞,、干細胞、神經(jīng)細胞,、外泌體,、類器官、活體動物,、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染,，已應(yīng)用于眾多著名期刊文獻中,，是進行細胞懸浮/貼壁狀態(tài),、活體和離體組織轉(zhuǎn)染的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)主流品牌之一。

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