高效液相系統(tǒng)一般由高壓輸液泵,、進(jìn)樣器、色譜柱,、檢測器,、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵,、色譜柱,、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置,、在線脫氣機(jī),、自動進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱,、柱溫控制器等,，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理,。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置,。

一、高壓輸液泵

高壓輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一,。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性,。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%,，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要,；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào),，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min,；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2,；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕,。

泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵,；恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵,、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵,。恒壓泵受柱阻影響,，流量不穩(wěn)定,；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰,。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵,。

柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml,，因此易于清洗和更換流動相,，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量,，流量不受柱阻影響,。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服,。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式,，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%）,，但出故障的機(jī)會較多（因多一單向閥）,，價(jià)格也較貴。

歐世盛是專業(yè)高壓輸液泵等精密儀器核心部件供應(yīng)商,，我們的高壓輸液泵采用耐腐蝕的材質(zhì),，瑞士單向閥，美國原裝密封圈和壓力傳感器,，使用壽命長,，冷壓柱塞桿，同軸度偏差最小,，特殊凸輪設(shè)計(jì),，減小壓力脈動，多種電機(jī)規(guī)格可供選擇,，電機(jī)等部件可選范圍廣,，流量精度高。進(jìn)口的品質(zhì),，國產(chǎn)的價(jià)格,，受到各行業(yè)的*！

二,、進(jìn)樣器

早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器,，裝在色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動進(jìn)樣器,。進(jìn)樣裝置要求：密封性好,，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣,，進(jìn)樣時(shí)對色譜系統(tǒng)的壓力,、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣,、停流進(jìn)樣,、閥進(jìn)樣、自動進(jìn)樣,。

【隔膜進(jìn)樣】

用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi),，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零,，可以獲得的柱效,，且價(jià)格便宜，操作方便,。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）,；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%,；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到,，常規(guī)分析使用受到限制。

【停流進(jìn)樣】

可避免在高壓下進(jìn)樣,。但在HPLC中由于隔膜的污染,，停泵或重新啟動時(shí)往往會出現(xiàn)“鬼峰"；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn),。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜>中,，效果較好。

【閥進(jìn)樣】

一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型）,，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成,。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右）,，但耐高壓（35~40MPa）,，進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%）,，操作方便,。

【自動進(jìn)樣】

用于大量樣品的常規(guī)分析。

三,、色譜柱

色譜是一種分離分析手段,，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟,。對色譜柱的要求是柱效高,、選擇性好,，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相,、氧化鋁,、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等,，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米,。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效,；對于同系物分析，只要500即可,；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子,，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響,，為使色譜柱達(dá)到效率,，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù),。即使裝填技術(shù),，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松,，易產(chǎn)生溝流,，流速較快，影響沖洗劑的流形,，使譜帶加寬,，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度,。在一般的液相色譜系統(tǒng)中,，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。

【柱的構(gòu)造】

色譜柱由柱管,、壓帽,、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）,、接頭,、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成,，壓力不高于時(shí),，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度,。為提高柱效,，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度,，其效果與拋光相同,。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱,。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板,，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20μm(5~10μm),，取決于填料粒度,，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類,，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱）,，內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm）,，柱長10~30cm,；②窄徑柱（又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn）,，內(nèi)徑1~2mm,，柱長10~20cm；③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn）,，內(nèi)徑0.2~0.5mm,；④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm,；⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱,，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm,；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米,。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定,，目的是為了避免管壁效應(yīng),。

【柱的發(fā)展方向】

因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm,，填料粒徑2~3μm,。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接,，而發(fā)展出窄徑柱,、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動相,；②靈敏度增加,；③樣品量少,；④能使用長柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫,；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用,。

但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著,，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測）,，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量,，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確,、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小,，要求高靈敏度的檢測器,，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn),。

【柱的填充和性能評價(jià)】

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外,，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下,，填料粒度＞20μm時(shí),，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20μm時(shí),，濕法填充較為理想,。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充,；②徑向加壓法,，Waters>；③軸向加壓法,，主要用于裝填大直徑柱,；④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng),，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱,。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得,，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié),，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理,。

四,、檢測器

檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?。HPLC的檢測器要求靈敏度高,、噪音低（即對溫度,、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬,、重復(fù)性好和適用范圍廣,。

【分類】

按原理可分為光學(xué)檢測器（如紫外、熒光,、示差折光,、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測器（如吸附熱）,、電化學(xué)檢測器（如極譜,、庫侖、安培）,、電學(xué)檢測器（電導(dǎo),、介電常數(shù)、壓電石英頻率）,、放射性檢測器（閃爍計(jì)數(shù),、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器,。

按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）,。通用型檢測器測量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng),，如示差折光,、蒸發(fā)光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低,。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì),，如紫外、熒光檢測器,，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng),。

按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測器的響應(yīng)與流動相中組分的濃度有關(guān),，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān),。

檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。

【性能指標(biāo)】

噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后,，記錄基線1小時(shí),，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移,。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性,，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器,，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度,、含有氣泡,、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準(zhǔn)確度,，應(yīng)盡量減小,。

靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時(shí)所給出的信號大小。對濃度型檢測器,，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小,，單位為mV·ml/g。對質(zhì)量型檢測器,，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小,，單位為mV·s/g。

檢測限：檢測器靈敏度的高低,，并不等于它檢測最小樣品量或樣品濃度能力的高低,，因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí)，沒有考慮噪聲的大小,，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的,。

檢測限是檢測器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小,，檢測器性能越好,。值得注意的是,，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外,，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān),。

線性范圍：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍,，即在固定靈敏度下，與最小進(jìn)樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比,。也可用響應(yīng)信號的與最小的范圍表示,，例如

檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。

線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定,。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些,，能同時(shí)測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小,，受溫度和流速的影響小,，能適合梯度洗脫檢測等。

池體積：除制備色譜外,，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10μl,。在使用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到1~2μl甚至更低,，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張問題就會很嚴(yán)重,。而且這時(shí)池體,、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì),，否則會嚴(yán)重影響柱效和靈敏度,。

五、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)

早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號,，再手工測量計(jì)算,。其后，使用積分儀計(jì)算并打印出峰高,、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù),。80年代后，計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速,、簡便,、準(zhǔn)確、精密和自動化,，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù),。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：①采集、處理和分析數(shù)據(jù),；②控制儀器,；③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。

六,、恒溫裝置

在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度,，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高,。

溫度對溶劑的溶解能力,、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響,。一般來說,，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動相中的溶解度,，從而降低其分配系數(shù)K,，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低,，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓,。但溫度太高易使流動相產(chǎn)生氣泡。

色譜柱的不同工作溫度對保留時(shí)間,、相對保留時(shí)間都有影響,。在凝膠色譜中使用軟填料時(shí)溫度會引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對分離有影響,；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大,。

總的說來,，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著,，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作,。在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時(shí)溫度對保留值的影響很大,。

不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣,。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時(shí)，就會造成基線漂移起伏,。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度控制精度,，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內(nèi),。