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酶標儀工作原理與應用
酶標儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計,，其基本工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計基本相同. 圖示是一種單通道自動進樣的酶標儀工作原理圖.光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光,，進入塑料微孔極中的待測標本.該單色光一部分被標本吸收,，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上,，光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉(zhuǎn)換成相應的電信號.電信號經(jīng)前置放大,，對數(shù)放大,，模數(shù)轉(zhuǎn)換等信號處理后送入微處理器進行數(shù)據(jù)處理和計算,，最后由顯示器和打印機顯示結(jié)果. 微處理機還通過控制電路控制機械驅(qū)動機構(gòu)X方向和Y方向的運動來移動微孔板,，從而實現(xiàn)自動進樣檢測過程.而另一些酶標儀則是采用手工移動微孔板進行檢測，因此省去了X,Y方向的機械驅(qū)動機構(gòu)和控制電路,，從而使儀器更小巧,，結(jié)構(gòu)也更簡單.
微孔板是一種經(jīng)事先包埋專用于放置待測樣本的透明塑料板，板上有多排大小均勻一致的小孔,，孔內(nèi)都包埋著相應的抗原或抗體,，微孔板上每個小孔可盛放零點幾毫升的溶液.
光是電磁波，波長100nm~400nm稱為紫外光,，400nm~780nm之間的光可被人眼觀察到,，大于780nm稱為紅外光。人們之所以能夠看到色彩,，是因為光照射到物體上被物體反射回來,。綠色植物之所以是綠色，是因為植物吸收的大部分為紅橙光和藍紫光,，但對綠色不吸收,，反射出來，所以植物呈現(xiàn)為綠色,。酶標儀測定的原理是在特定波長下,，檢測被測物的吸光值。
隨著檢測方式的發(fā)展,，擁有多種檢測模式的單體臺式酶標儀叫做多功能酶標儀,，可檢測吸光度(Abs)、熒光強度(FI),、時間分辨熒光(TRF),、熒光偏振(FP),、和化學發(fā)光(Lum)。
酶標儀從原理上可以分為光柵型酶標儀和濾光片型酶標儀,。光柵型酶標儀可以截取光源波長范圍內(nèi)的任意波長,，而濾光片型酶標儀則根據(jù)選配的濾光片，只能截取特定波長進行檢測,。
檢測單位
光通過被檢測物,，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下,，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系,。
檢測單位用OD值表示， OD是optical density(光密度)的縮寫,，表示被檢測物吸收掉的光密度,， OD=log(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值,。根據(jù)Bouger-amberT-beer法則,，OD值與光強度成下述關(guān)系:
E=OD=log(lo/Ι) 其中E表示被吸收的光密度， Ιo 為在檢測物之前的光強度,，Ι為從被檢測物出來的光強度,。
OD值由下述公式計算:
c為檢測物的濃度 b為檢測物的厚度 a為摩爾因子
在特定波長下測定每一種物質(zhì)都有其特定的波長，在此波長下,，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量,。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結(jié)果的不準確,。因此,，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測,，稱為測量波長,。
但是每一種物質(zhì)對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收,，我們再選取一個參照波長,，以消除這個不準確性。在參照波長下,，檢測物光的吸收最小,。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。
檢測值計算
儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量,，轉(zhuǎn)換成二進位數(shù)字信號,，最大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為 0%,，沒有檢測物的透光值為100%,。則實際檢測中,，檢測物的透光值均在 0%一100%之間。透光值
的計算如下:
T=(Meas-Min)/(Max-Min)
其中T為透光值,， Meas為檢測的二進位數(shù)值,， Min為在 0%的情況下檢測的二進位數(shù)值， Max為在100%的情況下檢測的二進位數(shù)值,，舉例如下:
MaX=3600
Min=20
Meas=30
T=(30-20)/3600-20)=0.0028
OD=log(1/T)=log(1/0.0028)=2.552
中心定位
儀器會自動對酶標孔進行中心定位,，中心定位是要消除酶標孔底的凸凹引起的厚薄不均帶來檢測的不準確。在對每一個酶標儀進行檢測時,，儀器其實要進行35個點的測量,，選取最中間的5個點的均值為本孔的OD值。
光源的參照通道
參照通道是用來校準由于電壓不穩(wěn)或燈泡磨損帶來的影響,。
用途和其它提示
用于ELISA試劑的測定,，廣泛用于各種實驗室，包括臨床實驗室,。
質(zhì)量控制
質(zhì)量控制是試劑檢測的重要因素,。請按照試劑說明書的要求進行質(zhì)量控制。
空白校正
有一些試劑盒的說明書將空白孔設(shè)置為空氣,，其它大多數(shù)空白孔的設(shè)置是用試劑來設(shè)置的，請按照試劑盒的說明書要求進行,。
檢測結(jié)果的解釋
由于有相當多的因素會影響檢測的結(jié)果,，如不同的酶標板，檢測試劑的體積,，都會造成OD值的不同,，因此，只有使用同一酶標板反應的試劑檢測結(jié)果才能比較和分析,。對結(jié)果的臨床解釋請依照試劑盒的說明書進行.
結(jié)構(gòu)
規(guī)格有24孔板,，48孔板，96孔板等多種,，不同的儀器選用不同規(guī)格的孔板,，對其可進行一孔一孔地檢測或一排一排地檢測.
酶標儀所用的單色光既可通過相干濾光片來獲得，也可用分光光度計相同的單色器來得到.在使用濾光片作濾波裝置時與普通比色計一樣,，濾光片即可放在微孔板的前面,，也可放在微孔板的后面，聚光鏡,，光欄后到達反射鏡,，經(jīng)反射鏡作90°反射后垂直通過比色溶液,然后再經(jīng)濾光片送到光電管.
從酶標儀工作框圖和光路圖上可看出，它和普通的光電比色計有以下幾點差異:
(l)盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿,，而是使用塑料微孔板.微孔板常用透明的聚乙烯材料制成,，對抗原抗體有較強的吸附作用,，故用它作為固相載體.
⑵由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的，光線只能垂直穿過,，因此酶標儀的光束都是垂直通過待測溶液和微孔板的,，光束既可是從上到下，也可以是從下到上穿過比色液.
⑶酶標儀通常不僅用A,，有時也使用光密度OD來表示吸光度.酶標儀可分為單通道和多通道2種類型,，單通道又有自動和手動2種之分.自動型的儀器有X,Y方向的機械驅(qū)動機構(gòu)，可將微孔板L的小孔一個個依次送入光束下面測試,，手動型則靠手工移動微孔板來進行測量.
在單通道酶標儀的基礎(chǔ)上又發(fā)展了多通道酶標儀,，此類酶標儀一般都是自動化型的.它沒有多個光束和多個光電檢測器，如 12個通道的儀器設(shè)有 12條光束或 12個光源,，12個檢測器和12個放大器,，在X方向的機械驅(qū)動裝置的作用下，樣品12個為一排被檢測.多通道酶標儀的檢測速度快,，但其結(jié)構(gòu)較復雜價格也較高.
用途
可廣泛應用于低紫外區(qū)的DNA,、RNA定量及純度分析(A260/A280)和蛋白定量(A280/BCA/Braford/Lowry)，酶活,、酶動力學檢測,，酶聯(lián)免疫測定(ELISAs)，細胞增殖與毒性分析,，細胞凋亡檢測(MTT),，報告基因檢測及G蛋白偶聯(lián)受體分析(GPCR)等