激光共聚焦顯微鏡是一種先進(jìn)的細(xì)胞和分子生物學(xué)分析儀器，已被激光,，電子照相機(jī)和計(jì)算機(jī)圖像處理等現(xiàn)代高科技手段所滲透,，并與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相結(jié)合。它以激光為光源,，采用共軛聚焦原理和裝置,，并使用計(jì)算機(jī)對(duì)觀察對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察，分析和輸出,。它的特征是對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描和成像,，對(duì)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行非侵入式觀察和分析。同時(shí),，使用免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記探針,，該技術(shù)不僅可以觀察固定的細(xì)胞和組織切片，還可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察和檢測(cè)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu),，分子,，離子和生命活動(dòng)。它越來(lái)越多地用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,，已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中重要的工具。
激光共聚焦顯微鏡也是活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察,、多重免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記觀察的有力工具,。不僅可對(duì)活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無(wú)損傷的“光學(xué)切片”,，進(jìn)行單標(biāo)記或雙標(biāo)記細(xì)胞及組織標(biāo)本的熒光定性定量分析；還可以用于活細(xì)胞生理信號(hào),，離子含量的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析監(jiān)測(cè),，粘附細(xì)胞的分選，細(xì)胞激光顯微外科和光陷阱技術(shù)等,?？梢詿o(wú)損傷的觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。
激光共聚焦顯微鏡的原理是用點(diǎn)光源照射試樣,，在焦平面上形成輪廓清晰的小光斑,。光斑照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光鏡,。光譜儀將熒光直接發(fā)送到檢測(cè)器,。光源和探測(cè)器前面有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和檢測(cè)針孔,。兩者的幾何尺寸相同,，約100-200納米；與焦平面上的光斑相比,，兩者是共軛的,，即光斑可以通過(guò)一系列透鏡同時(shí)聚焦在照明針孔和檢測(cè)針孔上。這樣,，來(lái)自焦平面的光可以會(huì)聚在檢測(cè)孔范圍內(nèi),，而來(lái)自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測(cè)孔之外而無(wú)法成像。激光逐點(diǎn)掃描樣本,，檢測(cè)到針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得相應(yīng)光點(diǎn)的共焦圖像,，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)。整個(gè)焦平面的清晰共焦圖像聚集在屏幕上,。
每個(gè)焦平面圖像實(shí)際上是樣品的光學(xué)橫截面,，這種光學(xué)截面總是具有一定的厚度，也稱為光學(xué)片,。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng),，且非焦平面光被針孔過(guò)濾，因此共焦系統(tǒng)的景深近似為零,。沿z軸掃描可實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描,，并在待觀察樣品的焦斑處形成二維光學(xué)切片。將X-Y平面（焦平面）掃描與z軸（光軸）掃描相結(jié)合,，將連續(xù)層次的二維圖像進(jìn)行累加,，經(jīng)專用計(jì)算機(jī)軟件處理，即可得到樣品的三維圖像,。即檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦在同一點(diǎn)上,，使得聚焦平面外激發(fā)的熒光無(wú)法進(jìn)入檢測(cè)針孔,。
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