一,、材料與儀器：

大鼠、裂解緩沖液,、濃蔗糖溶液,、超速離心機、組織研磨器

二,、實驗步驟：

1. 配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液（PMSF 在使用前添加）,，冰上放置。

裂解緩沖液:

① 0.25mol/L蔗糖網(wǎng)織紅細胞標準緩沖液（RSB）

② 0.25 mol/L 蔗糖（超級純）

③ 10mmol/Tris-HCl (pH7.4)

④ 10mmol/L NaCl

⑤ 3mmol/L MgCl2

⑥ 1mmol/L DTT

⑦ 0.5mmol/L PMSF (用前從溶于乙醇的100 mmol/L貯存液中添加）

濃蔗糖溶液:

①2mol/L蔗糖RSB

②2mol/L蔗糖（超級純）

③10mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

④10mmol/L NaCl

⑤3mmol/L MgCl2

⑥1mmol/L DTT

⑦0.5mmol/L PMSF（用前從溶于乙醇的100 mmol/L 貯存液中添加）

2. 超速離心機（Beckman 的與SW28轉(zhuǎn)頭兼容型）和轉(zhuǎn)頭預(yù)冷到4℃,。

3. 將組織研磨器（55 ml 的研磨腔； Thomas C 型腔和鋸齒型 Teflon 研杵,，3431-E25）。量筒和燒杯放到冰上,。

4. 在一冰桶的冰上放一玻璃盤。

5. 處死大鼠,，取出肝臟,，稱重。

6. 在一玻璃盤上,，用剃刀片快速去除結(jié)締組織,，將20g肝臟切成大約1cm³的小塊,。

7. 將肝臟碎塊裝入含40 ml ( 兩倍體積）裂解緩沖液的冷的燒杯中。

8. 將大約30ml這種肝臟碎塊和緩沖液混合物倒入預(yù)冷的組織研磨器腔中,。

9. 將研杵連到推進器,，便其滑到研磨腔中，直到觸到緩沖液面,。然后握住研磨腔側(cè)面,，打開推進器,。逐漸加大推進器速度直至其最高速度,，同時穩(wěn)定地將研磨腔沿轉(zhuǎn)動的研磨向上推進。當研杵到達研磨腔底部時,，向下拉研磨腔直到所有勻漿都從研杵旁通過，然后再將研磨腔沿研杵推回,。重復(fù)該過程5~10次后關(guān)掉推進器。

10. 檢查細胞的裂解效率：

(1) 將研磨腔放到冰上,，取出10μl裂解液,，用1ml裂解緩沖液稀釋,。

(2) 取2.7μl稀釋后的裂解液加到載玻片上,，再加上2.7μl 含 10μg/ml Hoechst 染料（33258 10 mg/ml,；Molecular Probes 或其他供應(yīng)商）的裂解緩沖液,，然后用一 18 mm² 的1號蓋玻片將液滴蓋上。

(3) 比較亮的DNA染色的細胞核與同一視野的相圖,。

(4) 如果裂解細胞數(shù)少于95%,，加大推進器速度，繼續(xù)研磨樣品5~10次,。

11. 在一漏斗中裝入4層粗孔濾紙,，放到一埋在冰浴中的量筒中，然后將勻漿倒進漏斗,。

12. 裂解剩余的肝臟碎塊,，勻漿通過濾紙過濾與其余裂解物樣品混和,，記錄得到的裂解物體積。

13. 將裂解物體積除以 6,，再從離心管體積（35~38 ml) 中減去該體積,。即可確定加入 6 個離心管中的濃蔗糖溶液的體積。在2mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至終濃度為0.5 mmol/Lol/L,。取適當體積（通常為25~30 ml ) 加到離心管中,，冰上放置。

14. 向離心管中加入濃蔗糖溶液和等體積裂解物（通常7~9ml ),。加裂解物時,，應(yīng)將移液管頭靠在離心管內(nèi)壁上部使裂解物緩慢流下,，這樣可減少裂解物與蔗糖溶液的混和,。

15. 將離心管放到預(yù)冷的轉(zhuǎn)桶中,，對面的轉(zhuǎn)桶用裂解緩沖液平衡。

16. 轉(zhuǎn)桶在SW28 轉(zhuǎn)頭上裝好,，放進預(yù)冷的離心機中,，23000g，4℃離心30分鐘,。

17. 吸出裂解物和蔗糖溶液,，或者在一燒杯上將離心管倒轉(zhuǎn)將液體倒出。用一無絨紙巾清除內(nèi)壁上的殘余物質(zhì),，離心管放置于冰上,。每管加入 2 ml 裂解緩沖液重新懸浮沉淀。

18. 將沉淀的重懸浮液集中到一個50ml的離心管（錐形或圓形底）中,，加裂解緩沖液至 50ml 終體積,，在醫(yī)用離心管中1500g離心5分鐘。

19. 吸出上清,，細胞核沉淀重懸浮于1 ml 的裂解緩沖液中,。取出少量樣品稀釋100 倍后在血球計數(shù)板上計數(shù)細胞核數(shù)目。

20.用裂解緩沖液將樣品稀釋到期望濃度的兩倍,，加入等體積甘油,，放液氮中冷凍，-80℃保存,。