實驗方法原理：

       細胞凍存和復蘇的基本原理是慢凍快解凍,，已被證明能最大限度地提高細胞活力。目前常用甘油或二甲基亞砜作為細胞低溫保存的保護劑,。這兩種物質(zhì)可以提高細胞膜對水的滲透性,，再加上緩慢的冷凍可以使細胞內(nèi)的水從細胞中滲出，減少細胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少冰晶形成對細胞的損傷,。復蘇細胞時應(yīng)采用快速熔融的方法，以保證細胞外晶體在短時間內(nèi)熔融,，以避免因水緩慢熔融進入細胞形成細胞內(nèi)重結(jié)晶而對細胞造成損傷,。

實驗材料：細胞

試劑、試劑盒：

       D-Hanks液 ,、小牛血清 ,、培養(yǎng)液、 青霉素,、 鏈霉素,、 胰蛋白酶、 HCl ,、NaHCO3,、 DMSO、 甘油

儀器,、耗材：

微量加樣槍,、吸頭、 離心管,、 凍存管 ,、槍頭、 膠塞 ,、移液管玻璃瓶,、 紅血球計數(shù)板、 記號筆,、 醫(yī)用橡皮膏 ,、移液槍 、超凈工作臺 ,、離心機 ,、恒溫水浴箱、 冰箱,、 倒置相差顯微鏡 ,、培養(yǎng)箱 、液氮冰箱

實驗步驟：

1,、細胞凍存

①10%DMSO或甘油冷凍培養(yǎng)基的制備10～20%小牛血清,。

② 對數(shù)生長期細胞用胰蛋白酶消化,，懸液中生長的細胞直接移到15 ml離心管。

③離心機轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn),，5分鐘,。

④除去胰蛋白酶和舊培養(yǎng)基，加入適量配制好的冷凍培養(yǎng)基,。用吸管輕輕吹氣使細胞均勻,、計數(shù)，調(diào)整凍液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml,。

⑤細胞分成深低溫保存管,，每管1～1.5ml。

⑥低溫保存管上標明細胞名稱,、冷凍時間和操作人員,。

⑦冷凍：標準的冷凍程序是冷卻速度為-1～-2°C/min。溫度低于-25℃時,，可提高到-5°C~-10°C / min.,。在-100℃時，可快速浸入液氮中,。含有細胞的冷凍保存管也可以放在-20°C的冰箱里2個小時,，然后放入-70°D的冰箱中過夜。取出冷凍管并將其移到液氮容器中,。

2,、細胞復蘇：

①將冷凍管從液氮容器中取出，直接浸入37°C溫水中,，并不時搖晃,，使其盡快融化。

②從37°C水浴中取出凍存管,，打開蓋子，用移液器吸出細胞懸液,，加入離心管滴下培養(yǎng)液10倍以上,，攪拌均勻。       

③離心,，1000轉(zhuǎn)/分鐘,，5分鐘。

④棄去上清液,，加入10%小牛血清培養(yǎng)基懸浮細胞,，計數(shù)，調(diào)整細胞密度,，接種培養(yǎng)瓶,，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng),。

⑤第二天更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng),。

注冊事項：

①從增殖期到形成致密單層細胞的培養(yǎng)細胞可用于低溫保存,，但優(yōu)選對數(shù)生長期細胞。冷凍前一天最好換培養(yǎng)基,。

②將冷凍儲存管放入液氮容器或取出時,，要做好防護工作，避免凍傷,。,。

③冷凍復蘇時，最好使用新配制的培養(yǎng)基,。