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實(shí)驗(yàn)方法原理：

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、 樣品RNA的抽提

1.  取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解,。

 2.  兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的，蓋緊管蓋,。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后,，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12 000 rpm離心15分鐘,。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相,，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中,。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

3.  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘,。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊,。

4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制）,，清洗RNA沉淀,。混勻后,，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。

5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘,。

6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,，使其*溶解,，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
 

二,、 RNA質(zhì)量檢測(cè)

1.  紫外吸收法測(cè)定

    先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零,。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度,。

    灌制凝膠板,，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,，將凝膠板放入電泳槽內(nèi),，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

（2）準(zhǔn)備RNA樣品

    取3 μgRNA,，加3倍體積的甲醛上樣染液,，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 μg/ml,。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

（3）電泳

     上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min,，隨后將樣品加入上樣孔,。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm,。

（4）紫外透射光下觀(guān)察并拍照

     28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍,。還有可能觀(guān)察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶,，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),，可能是由mRNA和其它異型RNA組成,。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染,，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散,。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。