采用真空冷凍干燥法保存微生物(如菌種、病毒等)或生物系統(tǒng)(如血液細(xì)胞,、角膜等)是目前便捷的一種方法,。由于凍干藥品呈多孔狀、可長期貯存,、復(fù)水性好,，且可恢復(fù)活性，因此冷凍干燥技術(shù)廣泛應(yīng)用于制備固體蛋白質(zhì)藥物,、口服速溶藥物及藥物包埋劑脂質(zhì)體等,。從國家食品藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫得知,，目前國內(nèi)已有注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b,、凍干鼠表皮生長因子,、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶,、注射用重組人白介素-2,、注射用重組人生長激素、注射用A群鏈球菌,、注射用重組人干擾素α2b,、凍干人凝血因子VⅢ、凍干人纖維蛋白原等凍干藥品已獲準(zhǔn)上市,。
目前認(rèn)為凍結(jié)過程對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)理主要是溶質(zhì)效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng),。當(dāng)細(xì)胞溶液的溫度降到其平衡凍結(jié)點(diǎn)以下一定的過冷度后，細(xì)胞外溶液首先結(jié)晶,，純水的凍結(jié)使細(xì)胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮,，電解質(zhì)濃度顯著增強(qiáng)，溶液的pH,、離子強(qiáng)度,、滲透壓發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性以及細(xì)胞脫水死亡,，即所謂的溶質(zhì)效應(yīng),。在預(yù)凍過程中，細(xì)胞內(nèi)的水分結(jié)冰,，體積膨脹,，細(xì)胞內(nèi)的冰晶生長對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜產(chǎn)生機(jī)械剪切破壞，稱為機(jī)械效應(yīng),。冷凍速率越快,，胞內(nèi)冰晶形成的數(shù)量越多，機(jī)械損傷就越大,。此外,，凍結(jié)過程對(duì)細(xì)胞凍干效果也至關(guān)重要，如果不能提供有效的預(yù)凍條件,，隨后的干燥過程也會(huì)加速細(xì)胞的損傷和死亡,。生物制品的玻璃化保存是避免冰晶生長的主要措施，也是實(shí)現(xiàn)生物體低溫保存的主要途徑,。如用海藻糖做保護(hù)劑實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞的玻璃化保存,，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到臨床輸注標(biāo)準(zhǔn)。
真空冷凍干燥過程對(duì)細(xì)胞損傷的兩大根源是細(xì)胞膜的融合與膜脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變。在正常生理?xiàng)l件下,，細(xì)胞膜中的磷脂的極性基團(tuán)通過與水分子結(jié)合而在空間上相互隔開,，但細(xì)胞膜失水后，極性基團(tuán)的聚合密度增大,，膜上的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間,、蛋白質(zhì)與脂類之間發(fā)生相互作用，以極性基團(tuán)間的氫鍵結(jié)合來補(bǔ)償丟失水分中的氫,，導(dǎo)致胞膜融合、破損,，內(nèi)容物外溢,。這種強(qiáng)烈的相互作用還導(dǎo)致相轉(zhuǎn)變溫度升高，如卵磷脂在水合時(shí)的相轉(zhuǎn)變溫度約為-7℃,，而在脫水時(shí)升高至約70℃,。故干脂膜在室溫下處于凝膠相，很容易發(fā)生不可逆的相分離,，此外,，在復(fù)水過程中，處于凝膠相的脂膜會(huì)向液晶相轉(zhuǎn)變,，造成膜通透性增加,，使細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)自由雙向交換，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂,。
所以應(yīng)尋找適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑,，一方面具有較高的玻璃化溫度，在凍結(jié)過程中能降低冰晶和溶質(zhì)的損失;另一方面又能在干燥過程中代替水分子穩(wěn)定細(xì)胞膜骨架,，保持其完整性,。
對(duì)于低溫保護(hù)作用，液體狀態(tài)下蛋白質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)理之一是“優(yōu)先排阻”假說,。該假說由Timasheff等首先提出的用以解釋溶液中糖類保護(hù)作用的機(jī)制,。他認(rèn)為糖類不直接與生物分子結(jié)構(gòu)相互作用，而是優(yōu)先與其表面的水分子結(jié)合,，使得生物分子表面穩(wěn)定劑量濃度比溶液中的低,，生物分子優(yōu)先水化，表面張力增加,，化學(xué)勢升高,，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定；而保護(hù)劑則優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（即優(yōu)先排斥）,。專家認(rèn)為溶液中溶質(zhì)(穩(wěn)定劑或去穩(wěn)定劑分子）與生物分子的優(yōu)先相互作用包括優(yōu)先排阻和優(yōu)先結(jié)合,。其中優(yōu)先排阻作用穩(wěn)定生物分子結(jié)構(gòu)，優(yōu)先結(jié)合作用破壞生物分子結(jié)構(gòu)。溶質(zhì)對(duì)生物分子穩(wěn)定性的影響取決于優(yōu)先結(jié)合與優(yōu)先排阻作用的平衡,，該平衡與溶質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和生物分子的表面性質(zhì)有關(guān),。
“優(yōu)先排阻”假說同樣適用于冷凍-融化過程。蛋白質(zhì)保護(hù)劑在溶液中被從蛋白質(zhì)表面排斥,，在凍結(jié)過程中能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì),。但是優(yōu)先作用機(jī)理不能解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。
在凍干過程中,，由于蛋白質(zhì)的水合層被除去,，優(yōu)先作用機(jī)理不再適用。對(duì)于凍干保護(hù)機(jī)理,，仍在研究探討之中,，目前主要有兩種:
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn):自然界中存在的、能夠在低溫脫水狀態(tài)下存活的有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)聚集大量的二糖,，常見的為海藻糖和蔗糖,，故提出“水替代”假說來解釋二糖的保護(hù)機(jī)理。
該假說認(rèn)為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵,，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接,。在冷凍干燥過程中，當(dāng)生物大分子失去結(jié)合水膜后,，雙糖分子中的羥基能在其失水部位以氫鍵形式與之連接,，及時(shí)形成一層假定的水化膜，這樣可保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中,，在物理狀態(tài)上保持與結(jié)合水存在時(shí)相似,，從而保持了生物分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性,，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下,，仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。另外,，二糖的存在還有助于降低脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變溫度T?,。
如卵磷脂在蔗糖或海藻糖存在下，T?降低至-20°C,，比水合的卵磷脂的T?低10°C,，比無海藻糖干燥的卵磷脂的T?低90°C，這樣干膜脂質(zhì)在室溫下是液晶相,，避免了相分離的發(fā)生,，且在復(fù)水過程中也不會(huì)發(fā)生相轉(zhuǎn)變和脂質(zhì)雙分子層的泄露。
所謂玻璃化主要是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)(玻璃態(tài))的固化過程,。玻璃化固體分子之間的距離與液體分子間的距商沒有區(qū)別,、不形成冰晶。研究發(fā)現(xiàn)在玻璃態(tài)下，物質(zhì)兼有固體和流體的行為,，黏度高,，不容易形成結(jié)晶，且分子擴(kuò)散系數(shù)很低,，因而可將細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)分子支撐包裹起來,，形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體，使蛋白質(zhì)物質(zhì)的鏈段運(yùn)動(dòng)受阻,，阻止蛋白質(zhì)的伸展和沉淀,，維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而起到保護(hù)作用,。
該假說認(rèn)為玻璃化是在凍干過程中保護(hù)生物材料的要求,。玻璃化能夠在凍結(jié)過程中避免形成冰晶，從而可避免冰晶和溶質(zhì)損傷等凍結(jié)損傷;其次,，處于玻璃態(tài)的物質(zhì)具有高的黏度,，一般為10¹²~10¹? Pa·s,，當(dāng)玻璃化的保護(hù)劑包圍在生物分子的周圍時(shí),，大分子物質(zhì)的分子運(yùn)動(dòng)和分子變性反應(yīng)變得非常微弱，阻止了膜融合等由分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)造成的損傷,。所以為最大限度保持細(xì)胞的活性,，應(yīng)保證細(xì)胞在整個(gè)凍干過程中始終處于玻璃態(tài)，即低凍結(jié)溫度和干燥溫度應(yīng)始終低于系統(tǒng)的玻璃化溫度T’g,。T’g較高的糖類和高聚物有海藻糖,、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮,、聚乙二醇,、白蛋白、葡聚糖等,，其中海藻糖的T’g較高,，對(duì)凍干產(chǎn)品的保護(hù)作用更強(qiáng)，保存時(shí)間更長,。
對(duì)于細(xì)胞的保護(hù),，氫鍵和玻璃化都是必需的，所以兩個(gè)假說并不互相排斥,。舉個(gè)典型的例子具有較高T’g,，葡萄糖能夠與膜基團(tuán)直接相互作用，單獨(dú)使用時(shí)均不能阻止干態(tài)下脂質(zhì)膜的泄漏,，但兩者的組合使用能有效地保護(hù)脂質(zhì)膜,。所以，在血液細(xì)胞的冷凍干燥保存中宜采用二糖和高聚物組合作為凍干保護(hù)劑。
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