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傷口愈合實(shí)驗(yàn)的這個關(guān)鍵步驟,你掌握了嗎,?
傷口愈合實(shí)驗(yàn)是體外研究細(xì)胞遷移非常重要的實(shí)驗(yàn)。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個空白的無細(xì)胞的地帶,,然后對這個無細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察,;這些邊緣的細(xì)胞會開始進(jìn)行遷移活動,并且覆蓋整個無細(xì)胞的區(qū)域,,重新互相接觸在一起,。本研究中用到傷口愈合的實(shí)驗(yàn),使用TARBP2和pri-miR130b共表達(dá),,通過對傷口愈合的速度的影響,,得出TARBP2-K52R可以*抑制pri-miR130b對傷口愈合過程的影響。
在文中,,使用Ibidi的傷口愈合插件進(jìn)行了傷口愈合實(shí)驗(yàn),。這是一種雙孔的硅膠插件,可以放在培養(yǎng)皿中,,插件兩孔間的孔壁寬度為500μm,。將細(xì)胞種在插件中,等待細(xì)胞貼壁長滿后,將插件移除,,這樣,,兩孔間的縫隙就是一個無細(xì)胞的500μm“劃痕"。
圖1 使用ibidi Culture-Insert 2 Well進(jìn)行傷口愈合測定的實(shí)驗(yàn)工作流程
1.實(shí)驗(yàn)材料
1) 細(xì)胞: serum starved A549luc stable cell line
2) 實(shí)驗(yàn)耗材: 傷口愈合插件培養(yǎng)皿 (ibidi, 81176)
3) 細(xì)胞培養(yǎng)基: DMEM (Hyclone)
4) 試劑: Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
5) 滅菌鑷子
6)倒置顯微鏡,,最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細(xì)胞成像的頂部培養(yǎng)箱
2.實(shí)驗(yàn)步驟
步驟1:鋪細(xì)胞(圖二)
1.將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除,。
2.在ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入70μl 3x10 5的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動培養(yǎng)皿,。以防止細(xì)胞不均勻,。
3.將細(xì)胞在37°C和5%CO2下孵育至少24小時
圖2 A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞,。
步驟2:形成“劃痕"
1.采用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時
2.如圖三所示,,小心的用鑷子夾住插件的一個角,將插件移除,。
圖3 使用無菌鑷子移除ibidi 插件
3.移除插件后,,要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕"。
4.小心的用無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS清洗細(xì)胞,,之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),。
圖4 由ibidi插件移除產(chǎn)生無細(xì)胞500μm的縫隙
步驟3:采集顯微圖像分析
1.在顯微鏡下選取能同時看到“劃痕"和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像,“劃痕"的方向比較好是水平或者垂直,。
2.采集0h和10h的圖像,,并且分析每張圖的細(xì)胞覆蓋劃痕區(qū)的面積。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
如圖所示,,共表達(dá)pri-miR130b和TARBP2-WT(miR130b-WT)比單獨(dú)表達(dá)pri-miR130b(miR130b-con)對細(xì)胞遷移更有抑制作用,,而將pri-miR130b和TARBP2-K52R(miR130b-K52R)共表達(dá)對于細(xì)胞遷移基本沒有抑制作用了。
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