1.前言

在分子克隆實驗中，感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化是基因克隆的基礎(chǔ)步驟之一,。但相信很多同學(xué)在涂板后,，常常會出現(xiàn)平板上菌落稀少甚至“空空如也"的尷尬局面，這不僅耽誤我們的實驗進度,，還會消耗寶貴的試劑和時間,。實驗為何會卡在這一步？本篇文章,，將從幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手,，一起和大家好好探討一下這個問題。

2.感受態(tài)細胞“不給力"

感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率直接決定了實驗成敗。如果細胞本身質(zhì)量不佳,，后續(xù)操作再完好也無濟于事,。例如感受態(tài)細胞經(jīng)常反復(fù)凍融或長期儲存（超過6個月），則很有可能會導(dǎo)致其活性顯著下降,。

感受態(tài)細胞是非常脆弱的,，一些操作上的失誤同樣會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效率,，凍融過程中如果未將細胞置于冰上,，則可能會破壞細胞膜的脆弱結(jié)構(gòu)；解凍后若未及時使用（如放置超過10分鐘）,，細胞活性會快速下降,；加入質(zhì)粒后劇烈吹打也會破壞細胞膜，進一步降低轉(zhuǎn)化成功率,。正確的操作應(yīng)該是：凍融時需全程冰上操作,，解凍后立即進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，質(zhì)粒加入后僅需輕彈混勻,。

3 質(zhì)?！坝昧?不當(dāng)或與宿主菌不兼容

質(zhì)粒是轉(zhuǎn)化成功的核心，但它的用量常被忽視,。在感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化實驗中,，質(zhì)粒的用量需通過質(zhì)量（ng） 而非體積（μL）去控制。

若僅依賴體積添加,，就可能會因為質(zhì)粒濃度差異導(dǎo)致實際用量超出合理范圍（通常建議是 50-100 ng）,，進而影響轉(zhuǎn)化效率。我們可以利用分光光度計測量質(zhì)粒濃度,，再依照公式：體積（μL）= 目標(biāo)質(zhì)量（ng） / 質(zhì)粒濃度（ng/μL）,，計算出所需添加的體積。

某些質(zhì)粒需要特定宿主菌才能正常復(fù)制或表達,。例如pET系列質(zhì)粒需使用BL21(DE3)菌株表達蛋白,，因為該菌株通過λ噬菌體DE3溶源整合，染色體攜帶T7 RNA聚合酶基因,，可驅(qū)動pET質(zhì)粒的T7啟動子轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因,。若質(zhì)粒與宿主菌的復(fù)制起點不兼容不匹配，則可能導(dǎo)致質(zhì)粒無法復(fù)制,，轉(zhuǎn)化后無菌落,。

4 熱激條件不“精準(zhǔn)"

熱激是感受態(tài)細胞吸收質(zhì)粒的關(guān)鍵步驟，其溫度,、時間和操作順序需嚴(yán)格控制,。若條件不精準(zhǔn)，可能導(dǎo)致質(zhì)粒無法有效進入細胞或細胞膜修復(fù)過快,，影響轉(zhuǎn)化效率,。熱激時間過短，會導(dǎo)致無法充分打開細胞膜孔道,；而熱激時間過長則可能損傷細胞,。

熱激完后，我們還需要將細胞放在冰上冰浴一段時間,，這一步的目的是修復(fù)細胞膜裂隙,，避免細胞因膜結(jié)構(gòu)破損而死亡,。如果少了這一步，就可能導(dǎo)致細胞膜無法閉合,，轉(zhuǎn)化效率下降或細胞死亡,。

5 抗生素“過量"或“失效"

抗生素是篩選成功轉(zhuǎn)化的抗性菌落的關(guān)鍵,，但如果抗生素失效或濃度過高會直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化菌篩選失敗。儲存不當(dāng)或過期的抗生素會失去抑菌活性,，而濃度過高則會抑制目標(biāo)菌生長,。操作失誤，如使用添加錯誤類型抗性平板,，也會導(dǎo)致實驗失敗,。

6 涂板操作不“細致"

涂板是轉(zhuǎn)化的最后一步，一些操作上的細節(jié)疏漏也可能導(dǎo)致前功盡棄,。涂布量過多或過少會影響菌落密度與生長效率,，建議控制涂布量在10-50 μL。菌液未充分混勻或涂布器未覆蓋整個平板表面,，導(dǎo)致局部菌落過密或空白,。而如果使用涂布棒用力摩擦瓊脂表面，損傷細胞或菌液堆積,。

正確的操作應(yīng)該是：加入菌液后，使用無菌涂布棒輕柔旋轉(zhuǎn),，充分分散菌液,；涂布后需靜置5分鐘，待菌液被平板全部吸收后再倒置培養(yǎng),，防止冷凝水滴落污染菌落,。

安培生物致力成為推動生命科學(xué)進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè),?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國,。安培生物集進口試劑,、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù),。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué),、免疫學(xué),、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線,，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu),、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品,、技術(shù)支持與服務(wù)?？梢栽诘谝粫r間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù),。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴,，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁,。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨,，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術(shù)支持,，隨時為客戶提供服務(wù)