分子克隆實驗的流程及注意事項--二、TOPO克隆

時間：2025/3/18閱讀：457

二,、TOPO克隆

引物設計與PCR擴增
1. 目的片段 PCR 擴增引物合成時,，要求引物 5’端不可磷酸化修飾；

2. 建議使用高保真酶進行目的片段的 PCR 擴增，并摸索退火溫度,，優(yōu)化反應體系和程序,。

PCR產(chǎn)物的純化回收
1.PCR 反應后，產(chǎn)物應當進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,，判斷是否存在目的大小的條帶,；

2.推薦使用切膠回收的方式純化 ( 切膠時間最好控制在 3min 內，避免紫外照射對 DNA 的損傷 ),，回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測,，濃度應當≥ 30ng/μl，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶,；

3.回收濃度低時,，可通過增加 PCR 反應體系，采取多管反應單管回收的方式,，提高回收產(chǎn)物的濃度,。

目的片段連接至載體

1.連接反應體系按照說明書要求投入，各組分投入體積≥ 1μl,，若濃度過高可稀釋后使用,；

2.連接反應溫度可嘗試 25°C或 37°C，時間 5min,，若不長克隆或克隆空載體 / 假陽性,，時間可嘗試延長至 30min；

3.連接反應建議在 PCR 儀中進行,。

感受態(tài)轉化涂板

1.連接產(chǎn)物轉化的感受態(tài)細胞選擇使用 DH5α,、Fast-T1 等克隆用化學感受態(tài)細胞；

2.感受態(tài)細胞不可反復凍融使用,，-80°C取出后建議一次用完,；

3.重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細胞,；

4.熱激時間：按照感受態(tài)細胞說明書操作進行,；

5.平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉化的載體抗性需保持一致；

6.菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g,，3min）,，移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留100μl 重懸后全部涂板,；或吸取合適體積涂板,。

單克隆菌落PCR鑒定

1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過大或過小的單克隆菌落,；

2.挑取數(shù)個單克隆菌落進行鑒定分析,；

3.挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后,，吸取 1-2μl 作為PCR 反應（10/20μl 體系）模板；

4.推薦使用一對分別位于片段和載體的上下游引物進行 PCR 鑒定,。

常見問題分析：

不長克隆

1. 片段類型錯誤：只兼容 PCR 擴增產(chǎn)物,，且引物 5’端不可磷酸化修飾；
2. 片段投入不符合要求：片段應當切膠回收,，且回收濃度不低于 30ng/μl,；濃度過高時需稀釋使用，保證體系各組分投入體積不小于 1μl,；片段投入量應按照說明書公式計算,；
3. 連接反應不適當：反應應在 PCR 儀中進行，溫度可設置 25 或 37°C,，連接時間可從 5min延長至 30min,。

空載體 / 假陽性
1. PCR 擴增產(chǎn)物不單一：優(yōu)化 PCR 體系，提高特異性,；對目的片段切膠回收,；鑒定更多單克??；
2. 片段投入不符合要求：片段應當切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl,；濃度過高時需稀釋使用,，保證體系投入體積不小于 1μl；片段投入量應按照說明書公式計算,；
3. 連接反應不適當：反應應在 PCR 儀中進行,，溫度可設置 25 或 37°C，連接時間可從 5min延長至 30min,；
4. 菌液 PCR 用酶不適合：PCR 酶活應當不受雜質影響,，引物不應選擇插入片段 PCR 用引物進行檢測。

測序突變
1. 測序克隆數(shù)過少：測序單克隆數(shù)只有 1 個時,，測序信息部分可信,，建議多測幾個單克隆，檢查突變處的測序信號是否有問題,，突變是否從模板引入,；
2. 突變位置：若堿基突變位于引物處，建議重新合成引物再次實驗,；位于其他部位的突變,，應當使用高保真酶重新制備模板再次實驗。

測序片段不正確
1. PCR 擴增產(chǎn)物不單一：優(yōu)化 PCR 體系,，提高特異性,；對目的片段切膠回收,；鑒定更多單克隆,；

2. 模板存在 Amp/kana 抗性的質粒：對目的片段進行切膠回收,。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè),?？偛吭O在廣東，服務面向全國,。安培生物集進口試劑,、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務,。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學,、免疫學,、信號傳導和神經(jīng)科學等領域的產(chǎn)品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產(chǎn)品,，安培生物致力于為廣大的科研機構,、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術支持與服務,?？梢栽诘谝粫r間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務。專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持,，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴,，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應商,，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨,，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務

分子克隆實驗的流程及注意事項--二、TOPO克隆

會員登錄

收藏該商鋪

提示