一,、Small RNA 的概念

Small RNA是長度小于200nt的一類非編碼RNA,，承擔(dān)著關(guān)鍵性的調(diào)控功能,，主要包括三類，分別是miRNA,、piRNA以及 siRNA,，其中以miRNA研究最為廣泛。Small RNA的5'和3'末端分別有自由的磷酸基和羥基,，正是基于這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn),，Small RNA測序采用5'、3'兩端連接接頭法進(jìn)行Small RNA文庫構(gòu)建,。

二,、Small RNA建庫的原理

1.3'接頭連接

將RNA和3'接頭置于70℃條件下進(jìn)行變性，打開RNA及3'接頭可能存在的二級結(jié)構(gòu),。利用酶將 Small RNA的3'羥基和3'通用接頭進(jìn)行連接,。

2．多余3'接頭封閉

為了防止多余的3'接頭與5'接頭連接產(chǎn)生接頭二聚體，在5'接頭連接之前，需要將多余的3'接頭進(jìn)行封閉,。封閉是通過加入RT Primer與多余的3'接頭反向互補(bǔ)形成雙鏈結(jié)構(gòu),，從而有效阻止其與5'接頭連接，達(dá)到減少接頭二聚體的目的,。

3.5'接頭連接

5'接頭連接是基于Small RNA的5'端含有磷酸基團(tuán)，利用酶將5'接頭與Small RNA進(jìn)行連接,。如需要測試的Small RNA 5'端不含磷酸基團(tuán),，則連接不上5'接頭。5'接頭為RNA接頭,，自身可能形成二級結(jié)構(gòu),，使用前需要將5'接頭的二級結(jié)構(gòu)打開。

4．cDNA合成

利用3'接頭封閉時加入的RT Primer作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,。

5．PCR富集

使用帶有P5,、P7的引物進(jìn)行文庫富集。

6．文庫分選

擴(kuò)增后的文庫會有擴(kuò)增引物殘留及rRNA污染,。純化后的文庫推薦使用PAGE膠進(jìn)行分選,，可直觀獲得目的條帶。也可以使用雙輪磁珠分選,，但分選范圍較廣,，得到的Small RNA文庫純度較低。分選后的文庫miRNA在147bp處左右,。

三,、Small RNA建庫的操作流程

·Small RNA 建庫

Vazyme 針對 lllumina 高通量測序平臺定向開發(fā)的Small RNA文庫構(gòu)建專用試劑盒-VAHTS Small RNA Library Prep Kit for lllumina V2 (Vazyme #NR811)。

· Vazyme ＃NR811 產(chǎn)品優(yōu)勢

1．文庫豐度高：接頭污染少,，有效文庫比例高,，miRNA比例高、覆蓋種類多,，文庫數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠,；

2．樣本兼容范圍廣：動、植物細(xì)胞／組織總RNA,，分離純化的Small RNA,，以及其他類型總RNA（如外泌體總RNA）均可作為起始模板；起始模板投入低至10ng總RNA,；

3．多種純化方式可選：NR811中包含文庫構(gòu)建所需的所有組分,，提供磁珠分選和PAGE膠分離兩種文庫純化方式，可根據(jù)起始文庫質(zhì)量任意選擇,。

自備材料

1.Small RNA Index Primer

VAHTS Small RNA Index Primer Kit for Illumina (Vazyme #N813-816),。

2．RNA質(zhì)控

Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent #5067-1513)。

3．文庫質(zhì)控

Agilent DNA 1000 kit (Agilent #5067-1504)、Agilent High Sensitive Kit (Agilent #5067-4626),。

4．文庫純化

VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411),。

5．文庫分選

5.1PAGE膠分選：

6% Novex TBE PAGE gel 1.0 mM 10-well (Life Technologies #EC6265BOX)、5 x TBE,、Ultra GelRed Nucleic Acid Stain （Vazyme ＃GR501）或 SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（Life Technologies ＃S11494）,、3M醋酸鈉（pH 5.2）、無水乙醇,、新鮮配制的80％乙醇,。

5.2磁珠分選：

VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme ＃N411）、新鮮配制的80％乙醇,。

6．其他材料

Nucleas-free ddH2O,、RNase-free PCR管、低吸附EP管（Eppendorf＃022431021）,； Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品,、PCR儀、磁力架,、-80℃冰箱,、水浴鍋、離心機(jī),。

·注意事項

1．試劑盒各組分應(yīng)于標(biāo)注條件下保存：

1.15'接頭RL5 Adaptor為RNA接頭,，請置于-85～-65℃保存。

1.2 試劑盒中的各酶類組分,，請置于-30～-15℃保存,。使用前混勻并進(jìn)行短暫離心，避免粘附于管壁及管蓋,，造成損失,；使用時應(yīng)置于冰上，使用后及時按條件保存,，否則會導(dǎo)致酶活降低,。

1.3 RL3 Buffer V2比較粘稠，解凍混勻后請短暫離心收集至管底,，避免液體粘附于管蓋和管壁,，導(dǎo)致試劑損失。

2．RNA樣品質(zhì)控：

為保證建庫質(zhì)量,，實(shí)驗(yàn)開始前請對RNA樣品進(jìn)行質(zhì)控,，RNA樣品總量、純度和完整性應(yīng)滿足以下條件：

2.1以總RNA為起始模板,，請使用沉淀法（如trizol法）或者Small RNA專用提取試劑盒提取RNA樣品,，確保所使用的提取方法不會損失 Small RNA。

2.2總RNA模板的起始投入量應(yīng)≥10ng，若起始投入量過低,，不能確保文庫構(gòu)建成功,。

2.3 OD260／280比值介于1.8-2.2之間，使用Bioanalyzer進(jìn)行RNA完整性檢測,，RIN值27,；使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，則28S：18S≥1.5,，且無蛋白質(zhì)和基因組污染,。

3．操作過程注意事項：

3.1實(shí)驗(yàn)過程中請使用RNase-free的槍頭、EP管,、PCR管，吸取不同樣品時請更換槍頭,。

3.2 請佩戴手套,、口罩操作，接觸RNase-free空間外設(shè)備或其他工作區(qū)間后,，請更換手套,。

3.3 所有的試劑使用后請立即蓋上管蓋，避免污染,。

3.4實(shí)驗(yàn)過程中如需暫停,，請嚴(yán)格按照使用方法中注明的可停放點(diǎn)將樣品置于合適的溫度下保存，不正確的停放可能會降低建庫成功率,。

實(shí)驗(yàn)流程

1.3'接頭連接

將RL3 Adaptor,、RL3 Buffer V2、RL3 Enzyme mix V2取出,，解凍并混勻,、短暫離心收集至管底，置于冰上備用,，以下所有步驟均在冰上操作,。

不同起始量RNA投入，所需接頭量不同,，接頭量不足產(chǎn)出不夠,，接頭過量則接頭二聚體殘留較多。推薦按照下表對接頭進(jìn)行稀釋,、如血清,、血漿、外泌體RNA提取產(chǎn)物低于Qubit測定下限,，則按照最大體積6μl投入,，推薦按照10ng總RNA接頭稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋。

1.1 模板與接頭變性

將RNA底物自身以及RNA底物之間可能存在的二級結(jié)構(gòu)打開。根據(jù)模版RNA起始投入量稀釋 RL3 Adaptor,，在RNase-free的PCR管中按照下表配制反應(yīng)體系,。

1.2將PCR管置于提前預(yù)熱至70℃的PCR儀中反應(yīng)2min，反應(yīng)結(jié)束后立即取出置于冰上2 min,。

1.3向1.2的反應(yīng)管中依次加入如下組分：

1.4使用移液器吹打10-15次充分混勻,，短暫離心收集反應(yīng)液至管底。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運(yùn)行如下程序：

2．多余3'接頭封閉

將RT Primer取出,，解凍并混勻,，短暫離心收集至管底，置于冰上備用,，以下所有步驟均在冰上操作,。

2.1 根據(jù)模版RNA起始投入量，參照表格稀釋RT Primer,，再按照下表配制反應(yīng)體系,。

2.2 使用移液器吹打10～15次混勻，短暫離心收集至管底,。置于熱蓋的PCR儀中運(yùn)行如下程序：

3.5'接頭連接

將5'接頭RL5 Adaptor,、RL5 Buffer和RL5 Enzyme mix取出，解凍并混勻,、短暫離心收集至管底,，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作,。

3.1 5'接頭變性

RL5 Adaptor 自身可能形成二級結(jié)構(gòu),，使用前需變性打開二級結(jié)構(gòu)。根據(jù)模版RNA起始投入量,，參照表格稀釋RL5 Adaptor,，將稀釋好的RL5 Adaptor置于提前預(yù)熱至70℃的PCR儀中反應(yīng)2min，反應(yīng)結(jié)束后立即取出置于冰上,。

3.2 按照下表配制5'接頭連接反應(yīng)體系：

3.3 使用移液器吹打10～15次充分混勻,，短暫離心收集反應(yīng)液至管底。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運(yùn)行如下程序：

4． cDNA合成

將RT Buffer和 RT Enzyme mix V2取出,，解凍并混勻,、短暫離心收集至管底，置于冰上備用,。

4.1 按照下表配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：

4.2 使用移液器吹打10～15次充分混勻,，短暫離心收集反應(yīng)液至管底。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運(yùn)行如下程序：

5．文庫富集

將Universal Primer,、Index Primer和 Amplification mix 3取出,，解凍混勻后置于冰上備用,。5.1 按照下表配制反應(yīng)體系：

5.2將上述反應(yīng)液混勻，短暫離心收集至管底,。將反應(yīng)管置于熱蓋的PCR儀中運(yùn)行如下反應(yīng)程序：

6．PCR產(chǎn)物純化

6.1 將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出,，靜置使其平衡至室溫。

6.2 顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads 充分混勻,，吸取180μl（1.8x）加入到PCR產(chǎn)物中,，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。

6.3 室溫孵育10min,，使DNA結(jié)合到磁珠上,。

6.4 將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約10min）,，小心移除上清,。

6.5 保持樣品始終處于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec,，小心移除上清。

6.6 重復(fù)6.5一次,。

6.7 保持樣品始終處于磁力架上，室溫下開蓋干燥磁珠約5min,。

加入80％乙醇時不要吹散磁珠,。

最后移除上清時需使用10μl移液器將殘留液體吸干凈，避免磁珠過分干燥（龜裂）而降低回收效率,。

6.8 將樣品從磁力架上取出,，加入30μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器輕輕吹打充分混勻,，室溫靜置2 min后置于磁力架上,，待溶液澄清后（約5min），小心吸取28μl上清至一個新的Nuclease-free PCR管中,。

洗脫產(chǎn)物可在-30～-15℃暫存一周,。

6.9 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測文庫：取1μl純化后的PCR產(chǎn)物用 Agilent DNA 1000 chip分析，由于2100遷移率的影響,，最終文庫的主峰分布可能存在約6-8bp偏差,，如下圖所示：miRNA文庫的峰在143-147 bp處，piRNA文庫的峰在153-156bp處,。

注：A圖和B圖分別為1μg,、100ng小鼠肝臟總RNA起始的Small RNA文庫，147 bp處的主峰為miRNA,；C圖為1μg小鼠腎臟總RNA起始的Small RNA文庫,，147 bp處的主峰為miRNA,，153 bp處的主峰為piRNA。

7.文庫分選

根據(jù)6.9步驟中文庫質(zhì)控的結(jié)果選擇文庫分選純化方式,，如2100圖顯示120 bp處有較多接頭二聚體,、70-80 bp處有較多擴(kuò)增引物殘留以及160bp和190 bp處有明顯的rRNA，則建議選擇PAGE膠分離,；如接頭二聚體,、擴(kuò)增引物殘留以及rRNA較少則可以選擇磁珠進(jìn)行文庫分選。為確保最終有效文庫的比例,，建議使用PAGE膠進(jìn)行文庫分選,。方案A：6％非變性PAGE膠分選文庫

（1）將6％10孔非變性PAGE膠裝置于電泳槽中，向其中加入適量1xTBE電泳緩沖液,。

（2）向純化的PCR產(chǎn)物中加入5μl6xLoading Buffer 混勻后離心收集至管底,。

（3）取5μl pBR322／Mspl digest DNA Marker緩慢加入PAGE膠樣孔中。

（4）將混有Loading Buffer的PCR產(chǎn)物緩慢加入PAGE膠樣孔中,，每個樣品上兩個樣孔,，每孔15μl。

（5）上樣完成后,，120-150V電壓電泳約1h,，不同的電泳裝置電泳遷移速率可能不一致，所需電泳時間有差異,，待樣孔中的Loading Buffer藍(lán)色指示劑全部跑出膠板后約3-5min方可停止電泳,。

（6）將PAGE膠從電泳裝置中取出，將PAGE膠從膠板上剝下,。用Gel-red核酸染料染色10 min,，在凝膠成像儀中進(jìn)行觀察，如下圖所示,，大約140bp和150 bp處的條帶分別對應(yīng)于miRNA文庫和piRNA文庫的條帶,。

（7）用刀片將對應(yīng)的條帶割下放于事先準(zhǔn)備好的500μl低吸附EP管中（管底已用酒精燈燒過的1ml注射器針頭戳了數(shù)個小洞），將500 μl EP管套到1.5ml低吸附EP管中,，12,000 rpm（13,800xg）離心2min碾碎膠條,。膠條的碾碎程度取決于500μl EP管底部小洞的孔徑，所以只需使用注射器針頭戳穿即可,。

（8）離心完成后棄掉500μl EP管,，向裝有PAGE膠碎片的1.5ml EP管中加入250 μl GEBuffer，于50℃水浴鍋中溫育1-2h,。

（9）將步驟8的EP管于離心機(jī)中12,000 rpm（13,800xg）離心2min,，將蒸發(fā)到管壁的液體收集至管底。

（10）將步驟9的上清轉(zhuǎn)移至離心過濾柱 Filtration Column中12,000 rpm（13,800xg）離心2 min 收集液體,，棄去離心柱,，將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5ml低吸附EP管中,。

（11）向步驟10的上清中分別依次加入5μl Co-precipitator，30 μl 3M醋酸鈉（pH 5.2）和1ml無水乙醇,，振蕩混勻后于-80℃沉淀1h,。

（12）取出-80℃沉淀產(chǎn)物，于預(yù)冷至4℃的冷凍離心機(jī)中12,000 rpm（13,800xg）,，離心30 min,。

（13）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀,。向EP管中加入1ml新鮮配制的80％乙醇,，于預(yù)冷至4℃的冷凍離心機(jī)中，12,000 rpm（13,800xg）離心10min,。

（14）小心移除上清,，注意切勿吸取到白色沉淀。短暫離心將管壁上殘留的液體收集至管底,，小心移除殘留液體,，室溫開蓋干燥約10min。

（15）待步驟14產(chǎn)物中殘留的酒精全部揮發(fā),，加入15μl Nuclease-free ddH2O溶解沉淀,。
（16）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產(chǎn)物用Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應(yīng)該如下圖所示,，對應(yīng)的miRNA文庫條帶在147-149bp處,。
                 

方案B：雙輪磁珠分選文庫

（1）將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫,。

（2）顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads充分混勻，取25μl純化的PCR產(chǎn)物于200 μl PCR管中吸取32.5μl 磁珠（1.3x）加入到PCR產(chǎn)物中,，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻,。

 ( 3）室溫孵育5min，使DNA結(jié)合到磁珠上,。

（4）將樣品置于磁力架上,，待溶液澄清后（約5min），小心移取上清至新的Nuclease-free PCR管中,。

（5）向步驟4的產(chǎn)物中加入22.5μl磁珠（0.9x）,，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。（6）室溫孵育5min,，使DNA結(jié)合到磁珠上,。

（7）將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min）,，小心棄去上清,。

（8）保持樣品始終處于磁力架上,，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫下孵育30sec,，小心移除上清,。

（9）重復(fù)步驟8一次。

（10）保持樣品始終處于磁力架上,，室溫下開蓋干燥磁珠約5min,。加入80％乙醇時不要吹散磁珠；最后移除上清時需要使用10μl移液器將殘留液體吸干凈,；應(yīng)避免磁珠過分干燥（龜裂）而降低回收效率,。

（11）將樣品從磁力架上取出，加入17.5 μl Nuclease-free ddH2O,，使用移液器輕輕吹10次打充分混勻,，室溫靜置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min）,，小心吸取15μl上清至一個新的Nuclease-free PCR管中,。

（12）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產(chǎn)物用Agilent DNA 1000 chip 或Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應(yīng)該如圖所示,，對應(yīng)的miRNA文庫條帶在147-149 bp處,。

四、Small RNA建庫的常見FAQ

RT primer 能否在cDNA合成步驟添加,？

不能,。3'接頭連接完成后加入的RT primer與多余3'接頭反向互補(bǔ)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，可以有效阻止5'接頭與3'接頭連接,，從而減少接頭二聚體的形成,；另外，RT primer與已連上3'接頭的RNA底物方向互補(bǔ)可作為逆轉(zhuǎn)錄步驟的引物,，因此RT primer必須在3'接頭連接完成之后添加,。

·除常規(guī)的動植物總RNA外，其他類型的總RNA是否可以作為起始模板進(jìn)行文庫構(gòu)建,？

除動,、植物總RNA以及分離純化的Small RNA外，Vazyme ＃NR811可以兼容其他類型的總RNA,，比如外泌體總RNA作為起始模板,。下圖為以HeLa細(xì)胞培養(yǎng)物上清的外泌體總RNA為模板構(gòu)建的miRNA文庫（起始模板投入80ng）。

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