實(shí)驗(yàn)原理：

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子,，可以形成具有剛性的濾孔,，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。

DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷,，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng),。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng),。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同,，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同,，從而分出不同的區(qū)帶,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 配膠 首先根據(jù)DNA片段大小確定瓊脂糖凝膠濃度，稱取相應(yīng)質(zhì)量的瓊脂糖粉末于TAE/TBE緩沖液中溶解,，微波加熱1min左右取出（時(shí)間根據(jù)體積改變）,，加入Gelred染料，搖晃均勻后倒入模具,。

注：緩沖液為三乙酰-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE）或三硼酸-EDTA（TBE）,，三酸溶液是微堿性條件下的有效緩沖液，可保持DNA去質(zhì)子化并溶于水,。EDTA是一種螯合劑,，能使可能損害被分析的DNA的核酸酶失活。

表1 DNA片段大小與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系

2,、凝膠澆注

選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳齒,。輕柔地將加了染料的瓊脂糖凝膠溶液倒入模具中，觀察有無氣泡產(chǎn)生,，在膠未全部凝固的時(shí)候戳破,，否則會(huì)影響最終結(jié)果。注：速度不可太快,，否則容易出現(xiàn)氣泡,。

3、將樣品與DNA loading buffer混合

將樣品與含溴酚藍(lán)的loading buffer混合,，loading buffer可以幫助我們觀察樣品的位置,。

4、凝膠裝入

待膠變硬,，直到呈乳白色且不透明（約20-30 min）,，小心地垂直拔出梳齒，將膠塊放入電泳槽中,，確?？孜挥谪?fù)電極（一般為黑色）,，將運(yùn)行緩沖液（TAE或TBE）注入槽中，使凝膠被淹沒1-2 mm,。用移液器向泳道中加樣,，不要超過泳道載量，否則樣品會(huì)溢出,。

5,、凝膠運(yùn)行

確保電極沒有插反，否則樣品會(huì)跑到緩沖液中,。設(shè)定凝膠運(yùn)行的時(shí)間和電壓,，調(diào)節(jié)電壓至4-5V/cm，DNA從負(fù)極移到正極,，電泳時(shí)間30-60 min,，具體根據(jù)凝膠比例和片段大小進(jìn)行調(diào)整（一般120V，35 min即可）,。電泳結(jié)束后,，拔掉電源。

常見問題分析：

1.加樣孔有熒光

（1）提DNA時(shí)有蛋白質(zhì)殘留,。

（2）基因組DNA,，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔,，滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光,。

2.條帶扭曲呈波浪狀

（1）配制凝膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時(shí)配制的。

（2）電泳時(shí)電壓過高,?？梢栽陔娪厩?5分鐘用較低電壓（3 V/cm），等條帶出孔后,，再調(diào)電壓,。

（3）慢慢加樣，等樣品自然沉降后再加電壓,。

3.條帶彌散

（1）DNA發(fā)生降解,。

（2）電泳緩沖液陳舊（根據(jù)DNA Maker對(duì)照，觀察是否為電泳體系的問題）,。

（3）PCR過程產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增 （使用特異性較高的引物）,。

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