分子生物學(xué)實驗中經(jīng)常需要對樣品進行濃度和純度的測定,，它相當(dāng)于一種質(zhì)控，以此來確保下游實驗的結(jié)果可靠,。

常用的DNA濃度/純度測定設(shè)備是紫外分光光度計,，它的原理是利用物質(zhì)分子對紫外可見光譜區(qū)的輻射吸收來進行分析物質(zhì)成分。

這樣來描述可能有點生硬,，我們舉個栗子：

假設(shè)現(xiàn)在有一樣物質(zhì)A,，它溶解在溶液內(nèi)，當(dāng)光照射溶液時,，溶液內(nèi)的A會吸收一部分的光,。不同顏色的光有不同的波長，A對不同顏色的光（不同波長）的吸收程度是不一樣的,。

雙鏈的DNA,，它能對波長為260nm的光進行強烈的吸收，吸收的程度可以用一個叫吸光度的數(shù)值來測量,，濃度越高的DNA,，理論上吸光度也越高。

最后,，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度數(shù)值對比后,，就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。

DNA濃度測定通常會使用紫外分光光度計,，常見的有NanoDrop這類設(shè)備。除了DNA,，它還能測定RNA和蛋白的吸光度,。

要提高濃度測定的準(zhǔn)確性，需要注意以下幾點：

• 檢測之前,，務(wù)必充分混勻DNA溶液，因為這類機器的上樣檢測體積只需要1-2uL,，如果樣品沒有混勻,，那么每次檢測樣品濃度也會不一樣。

• 因為上樣體積很小,，所以樣品很容易揮發(fā),，如果把樣品加在檢測基座后不馬上檢測的話，會導(dǎo)致測出來的樣品濃度偏高,。

• 實驗環(huán)境和耗材的穩(wěn)定性要高,。檢測設(shè)備應(yīng)該在放置在溫度可控、通風(fēng)的環(huán)境下,；裝樣品的管子如果不是要進行吸取樣品操作的話,，需要時刻緊閉。

• 每次檢測完畢，都需要對檢測基座或者比色皿進行清洗和擦拭,，確保不會有樣品殘留后,，再進行下一次上樣檢測。

• 空白調(diào)零,，應(yīng)該使用溶解待檢測樣品的溶液來調(diào)零,。例如如果用水溶解DNA，那就用水調(diào)零,，用其他緩沖液溶解,，則用對應(yīng)的緩沖液調(diào)零。

在測定后,，我們通常會看到,，設(shè)備會提供幾個不同的結(jié)果給我們，有的是數(shù)值,，例如OD230,、OD260，有的是比值,，例如OD260:280,，那這些結(jié)果代表什么呢？

OD是optical density(光密度)的縮寫,表示被檢測物吸收的光密度,。

OD=lg(1/trans),，其中trans為被測物質(zhì)的透光值。

不同的OD以及OD比值,，代表不同的意義：

【OD230】

提取核酸時會用到各種化合物，它們以鹽離子的形式存在,，例如胍鹽,、苯氧基離子、硫氰酸酯,。

這些鹽離子對230nm波長的紫外光有強烈的吸收值,。如果測定核酸時，發(fā)現(xiàn)OD230數(shù)值很高,，代表溶液中的鹽離子濃度很高,。

【OD260】

雙鏈DNA在這個波長下會對光有強烈的吸收。

【OD280】

芳香族氨基酸在這個波長下,，有強烈的光吸收,。如果該數(shù)值很高，代表DNA溶液中可能存在蛋白質(zhì)的污染.

【OD320】

通常是由光散射造成的,。如果該數(shù)值很高,，意味著溶液內(nèi)有顆粒物污染,、待檢器皿例如比色皿有污漬。

【OD260:OD280】

通常用于判斷DNA或RNA溶液的純度,。常用的指標(biāo)是：在OD230數(shù)值較低,，OD320數(shù)值較低的前提下。較高純度的DNA,，比值應(yīng)該為1.7～1.9之間,，較高純度的RNA，比值應(yīng)該為1.9～2.0之間,。

當(dāng)然,，以上測定的結(jié)果并非是絕對計數(shù)的數(shù)值，它是一個參考數(shù)值,，因為我們在測定時是不涉及用到標(biāo)準(zhǔn)品這樣?xùn)|西,，所以，也就是我們測出來的數(shù)可以作為一定程度的參考,。

而且,，當(dāng)一些外界因素影響時，測定也會出現(xiàn)偏差,，例如樣本含量非常非常低時,，測定的數(shù)值誤差就會很高并不具參考意義，設(shè)備耗材出現(xiàn)問題時,，測定的數(shù)值也會不準(zhǔn),。

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