分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常需要對(duì)樣品進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定,，它相當(dāng)于一種質(zhì)控,，以此來(lái)確保下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可靠,。

常用的DNA濃度/純度測(cè)定設(shè)備是紫外分光光度計(jì)，它的原理是利用物質(zhì)分子對(duì)紫外可見(jiàn)光譜區(qū)的輻射吸收來(lái)進(jìn)行分析物質(zhì)成分,。

這樣來(lái)描述可能有點(diǎn)生硬,，我們舉個(gè)栗子：

假設(shè)現(xiàn)在有一樣物質(zhì)A，它溶解在溶液內(nèi),，當(dāng)光照射溶液時(shí),，溶液內(nèi)的A會(huì)吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長(zhǎng),，A對(duì)不同顏色的光（不同波長(zhǎng)）的吸收程度是不一樣的,。

雙鏈的DNA，它能對(duì)波長(zhǎng)為260nm的光進(jìn)行強(qiáng)烈的吸收,，吸收的程度可以用一個(gè)叫吸光度的數(shù)值來(lái)測(cè)量,，濃度越高的DNA，理論上吸光度也越高。

最后,，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度數(shù)值對(duì)比后,，就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。

DNA濃度測(cè)定通常會(huì)使用紫外分光光度計(jì),，常見(jiàn)的有NanoDrop這類(lèi)設(shè)備。除了DNA,，它還能測(cè)定RNA和蛋白的吸光度,。

要提高濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性，需要注意以下幾點(diǎn)：

• 檢測(cè)之前,，務(wù)必充分混勻DNA溶液,，因?yàn)檫@類(lèi)機(jī)器的上樣檢測(cè)體積只需要1-2uL，如果樣品沒(méi)有混勻,，那么每次檢測(cè)樣品濃度也會(huì)不一樣,。

• 因?yàn)樯蠘芋w積很小，所以樣品很容易揮發(fā),，如果把樣品加在檢測(cè)基座后不馬上檢測(cè)的話,，會(huì)導(dǎo)致測(cè)出來(lái)的樣品濃度偏高。

• 實(shí)驗(yàn)環(huán)境和耗材的穩(wěn)定性要高,。檢測(cè)設(shè)備應(yīng)該在放置在溫度可控,、通風(fēng)的環(huán)境下；裝樣品的管子如果不是要進(jìn)行吸取樣品操作的話,，需要時(shí)刻緊閉,。

• 每次檢測(cè)完畢，都需要對(duì)檢測(cè)基座或者比色皿進(jìn)行清洗和擦拭,，確保不會(huì)有樣品殘留后,，再進(jìn)行下一次上樣檢測(cè)。

• 空白調(diào)零,，應(yīng)該使用溶解待檢測(cè)樣品的溶液來(lái)調(diào)零,。例如如果用水溶解DNA，那就用水調(diào)零,，用其他緩沖液溶解,，則用對(duì)應(yīng)的緩沖液調(diào)零。

在測(cè)定后,，我們通常會(huì)看到,，設(shè)備會(huì)提供幾個(gè)不同的結(jié)果給我們，有的是數(shù)值,，例如OD230,、OD260,，有的是比值，例如OD260:280,，那這些結(jié)果代表什么呢,？

OD是optical density(光密度)的縮寫(xiě),表示被檢測(cè)物吸收的光密度。

OD=lg(1/trans),，其中trans為被測(cè)物質(zhì)的透光值,。

不同的OD以及OD比值，代表不同的意義：

【OD230】

提取核酸時(shí)會(huì)用到各種化合物,，它們以鹽離子的形式存在，例如胍鹽,、苯氧基離子,、硫氰酸酯。

這些鹽離子對(duì)230nm波長(zhǎng)的紫外光有強(qiáng)烈的吸收值,。如果測(cè)定核酸時(shí),，發(fā)現(xiàn)OD230數(shù)值很高，代表溶液中的鹽離子濃度很高,。

【OD260】

雙鏈DNA在這個(gè)波長(zhǎng)下會(huì)對(duì)光有強(qiáng)烈的吸收,。

【OD280】

芳香族氨基酸在這個(gè)波長(zhǎng)下,，有強(qiáng)烈的光吸收,。如果該數(shù)值很高，代表DNA溶液中可能存在蛋白質(zhì)的污染.

【OD320】

通常是由光散射造成的,。如果該數(shù)值很高,，意味著溶液內(nèi)有顆粒物污染、待檢器皿例如比色皿有污漬,。

【OD260:OD280】

通常用于判斷DNA或RNA溶液的純度,。常用的指標(biāo)是：在OD230數(shù)值較低，OD320數(shù)值較低的前提下,。較高純度的DNA,，比值應(yīng)該為1.7～1.9之間，較高純度的RNA,，比值應(yīng)該為1.9～2.0之間,。

當(dāng)然，以上測(cè)定的結(jié)果并非是絕對(duì)計(jì)數(shù)的數(shù)值,，它是一個(gè)參考數(shù)值,，因?yàn)槲覀冊(cè)跍y(cè)定時(shí)是不涉及用到標(biāo)準(zhǔn)品這樣?xùn)|西，所以,，也就是我們測(cè)出來(lái)的數(shù)可以作為一定程度的參考,。

而且,，當(dāng)一些外界因素影響時(shí)，測(cè)定也會(huì)出現(xiàn)偏差,，例如樣本含量非常非常低時(shí),，測(cè)定的數(shù)值誤差就會(huì)很高并不具參考意義，設(shè)備耗材出現(xiàn)問(wèn)題時(shí),，測(cè)定的數(shù)值也會(huì)不準(zhǔn),。

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