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CHO-K1倉鼠卵巢細胞株的培養(yǎng)方法

時間:2024/4/10閱讀:764
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中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細胞是第一個被美國FDA、歐盟EMA和中國CFDA認可的用于生物制藥領域的生產(chǎn)細胞,,已廣泛應用于各種治療性蛋白質藥物的大規(guī)模制備,,包括重組抗體、重組單體蛋白質以及重組融合蛋白質等,。CHO-K1是未經(jīng)改造的野生型CHO細胞。最原始的CHO-K1細胞是貼壁培養(yǎng),,并需要添加血清,,由于血清的批間穩(wěn)定性問題,及后來病毒安全性問題,,無血清懸浮培養(yǎng)成為趨勢,。實驗室常以貼壁的CHO K1細胞構建穩(wěn)轉細胞株。

 

                                圖片


細胞形態(tài):長梭形(10×倍鏡)
培養(yǎng)條件:DMEM/F12培養(yǎng)基,,胎牛血清終濃度為10%
培養(yǎng)溫度:37°C

細胞復蘇:


1.在攝氏37度的水浴中輕輕攪動,,為防止受到污染,不要把O形環(huán)和蓋子放在外面,。解凍應迅速(約2分鐘),。
2.解凍后把凍存管盡快從水中拿出來,用75% 乙醇浸泡或噴灑消毒乙醇,。從現(xiàn)在開始所有的操作都應該進行在嚴格的無菌條件下進行,。
3.將細胞懸液轉移到含有9 ml(血清)細胞培養(yǎng)基的離心管中,10000 rpm離心5分鐘,。
4.棄上清,,用(血清)細胞培養(yǎng)基重懸細胞,轉移至T25細胞培養(yǎng)瓶中,。
注意:在T25瓶加入細胞之前,,可以先將包含(血清)細胞培養(yǎng)基的容器放入培養(yǎng)箱內至少15分鐘,以便培養(yǎng)基達到正常PH(7.0至7.6),。
5.將培養(yǎng)瓶轉移至37℃,,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。


細胞傳代:


1.棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗兩遍細胞層,,以消除所有痕量的血清,。
2.加入2.0 ~ 3.0 mL  0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化細胞,在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散,。
注意:為了避免結塊,,請不要通過擊打或搖晃瓶子??稍?7℃培養(yǎng)箱等待細胞,,加快細胞分散的速度。
3.加入6 - 8 mL的(血清)細胞培養(yǎng)基終止消化并反復吹打,,轉移至離心管,,1000 rpm 5 min。
注意:(血清)細胞培養(yǎng)基里有血清,,血清里過量的血清蛋白與胰酶結合,,競爭性抑制,使胰酶無法繼續(xù)消化細胞,。
4.  棄上清,,添加新的培養(yǎng)基重懸細胞,向培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿中添加適當?shù)募毎麘腋∫?,并補充新鮮(血清)細胞培養(yǎng)基,。
5. 將培養(yǎng)瓶轉移至37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
注意:ATCC建議傳代比例為:1:4至1:8,。


細胞凍存:


1.當細胞處于對數(shù)生長期時,可進行細胞凍存,。
注意:常見的細胞凍存密度是1-10*10^6 cells/mL,。
2.棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗兩遍細胞層,,以消除所有痕量的血清和細胞生長過程中產(chǎn)生的廢料,。
3.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%(w/v)胰蛋白酶溶液消化細胞,在倒置顯微鏡下觀察細胞直到細胞層分散,。
4.加入適量的(血清)細胞培養(yǎng)基終止消化,,槍頭反復吹打混勻后將細胞懸液轉移至離心管,1000 rpm 5 min,。
5.棄上清,,依次加入700 μL培養(yǎng)基,200 μL胎牛血清重懸細胞,,最后添加 10% DMSO 后梯度降溫凍存,。

注意:DMSO加到細胞里會迅速放熱,,對細胞活力造成損傷,因此可以選擇在最后一步添加,,加完迅速轉移至低溫,。

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