一,、背景介紹

克隆形成實驗是研究細(xì)胞存活率并探討單個細(xì)胞增殖潛能的有效方法之一,。即在體外培養(yǎng)環(huán)境下,，通過使單個細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)分裂增殖至少6代,，形成的細(xì)胞集群被稱為克隆或集落,。每個克隆的尺寸通常在0.3-1.0mm之間,，含有50個以上的細(xì)胞。通過計算克隆形成率,，能夠?qū)蝹€細(xì)胞的增殖潛力進(jìn)行量化分析,。

用途：

（1）評估細(xì)胞增殖能力：克隆形成實驗可以幫助研究人員評估細(xì)胞的增殖潛力。通過觀察和計數(shù)形成的獨立克隆,，可以了解細(xì)胞在體外環(huán)境中的增殖速率和能力,。

(2)研究細(xì)胞群體依賴性：克隆形成實驗有助于了解細(xì)胞的群體依賴性，即細(xì)胞是否需要相互合作形成克隆,。這對于理解細(xì)胞群體內(nèi)的相互作用和細(xì)胞信號傳導(dǎo)至關(guān)重要,。

(3)篩選藥物和治療方案：克隆形成實驗可用于評估藥物對細(xì)胞增殖的影響。通過在實驗前后比較克隆形成率,，研究人員可以評估潛在藥物或治療方案的療效,。

常用的手段有兩個：

①平板克隆形成實驗：通過將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，主要適用于貼壁生長的細(xì)胞,，以評估細(xì)胞的克隆形成能力,。

②軟瓊脂克隆形成實驗：通過將細(xì)胞懸浮于含瓊脂糖的培養(yǎng)基中,，主要用于評估貼壁和懸浮的腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的克隆形成潛能。

二,、平板克隆形成實驗的實驗步驟

(1) 從細(xì)胞處于對數(shù)生長期狀態(tài)開始,，通過胰酶消化將細(xì)胞懸浮于血清培養(yǎng)基中，并進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù),；

(2) 在每個實驗組中,，控制細(xì)胞數(shù)量在400-1,000個細(xì)胞/孔的范圍內(nèi)（對于不同的細(xì)胞類型，需要進(jìn)行預(yù)實驗以確定最佳細(xì)胞數(shù)量）,，并接種于6孔板,；

(3) 持續(xù)培養(yǎng)至14天，或直到大多數(shù)單個克隆中的細(xì)胞數(shù)超過50個,。在培養(yǎng)過程中,，每隔3天更換培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞狀態(tài),；

(4) 克隆形成完成后,，使用1 mL 4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，固定時間為15-30分鐘,。最后,，用PBS洗滌；

(5) 向每個孔中加入1 mL結(jié)晶紫染液,，染色時間控制在10-20分鐘內(nèi),；

(6) 利用PBS進(jìn)行多次細(xì)胞洗滌，進(jìn)行拍照（分別對整個六孔板及每個孔進(jìn)行單獨拍照）,。

注意：本實驗的成功關(guān)鍵在于細(xì)胞懸液的制備和適度的接種密度,，務(wù)必確保細(xì)胞均勻分散，防止細(xì)胞團(tuán)的形成,，并謹(jǐn)慎確保接種密度不過于密集,。

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