背景介紹

Caco2細(xì)胞是常見(jiàn)的結(jié)腸腺癌細(xì)胞,，正常情況下,，Caco2細(xì)胞在培養(yǎng)的過(guò)程中貼壁生長(zhǎng),，其形態(tài)多為多邊形或梭形,，增殖速度較快,，其鏡下形態(tài)如下圖所示,，密度已大于90%，可以進(jìn)行傳代,。

圖：Caco2細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)方法

1.培養(yǎng)基配置：DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素雙抗+1%谷氨酰氨,。

2.其余需要準(zhǔn)備的試劑耗材包括：無(wú)菌PBS、胰酶,、無(wú)菌槍頭,、細(xì)胞培養(yǎng)皿、15ml離心管,、離心機(jī),、生物安全柜、水浴鍋,、75%酒精,。

3.培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱,。

4.細(xì)胞復(fù)蘇：提前將水浴鍋溫度調(diào)至37℃,，從液氮罐中拿出細(xì)胞,，迅速放在37℃水浴鍋中輕輕晃動(dòng)，使細(xì)胞快速融化,，融化后用移液器輕輕混勻,，將其轉(zhuǎn)移到15ml離心管內(nèi)，加入1-2ml培養(yǎng)基,，室溫800rpm離心5min,，去上清后加入1ml培養(yǎng)基重懸10次左右，將其全部加入6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)（提前加入4-6ml培養(yǎng)基）,，十字混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中,，24h觀察細(xì)胞密度進(jìn)行后續(xù)操作。

5.細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞密度≥90%時(shí),，進(jìn)行細(xì)胞傳代,，吸掉原有培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)皿邊緣加入1ml PBS清洗,，吸掉PBS后加入750μl含EDTA的胰酶消化,，消化時(shí)間2min左右，消化完成后加入1.5ml培養(yǎng)基中止消化,，用移液槍吹打,，保證細(xì)胞全部被吹下，將混合液全部轉(zhuǎn)移到離心管中,，室溫800rpm離心5min,，去上清后加入1ml培養(yǎng)基充分重懸，取333μl加入有4ml培養(yǎng)基的6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，十字混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),，1-3天后根據(jù)細(xì)胞密度換液或傳代。

6.細(xì)胞凍存：如前述收集細(xì)胞沉淀,，加入1ml凍存液（培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7：2：1）充分重懸,，將混合液移入凍存管內(nèi)，標(biāo)記好基本信息,，將凍存管入凍存盒后放入-80℃冰箱,，24h后可將凍存管放入-80℃冰箱細(xì)胞盒內(nèi)。

一些心得

1.細(xì)胞新復(fù)蘇后,，一般24h進(jìn)行補(bǔ)液2ml,，48h后再進(jìn)行傳代處理。對(duì)于新復(fù)蘇的細(xì)胞由于比較脆弱,，一般第一次傳代比例為1：2。

2.Caco2細(xì)胞增殖較快,，上述提到的333μl是按常規(guī)1：3的比例進(jìn)行傳代,，最大比例應(yīng)不超過(guò)1：7,。就我個(gè)人來(lái)說(shuō)，1：3傳代2天即可長(zhǎng)滿,，僅作為參考,。

3.對(duì)于新復(fù)蘇的細(xì)胞，若要凍存,，最少應(yīng)該傳一代再進(jìn)行凍存,。同樣如果要進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染等對(duì)細(xì)胞有較大傷害的操作時(shí)，最少應(yīng)該傳兩代,，保證細(xì)胞質(zhì)量良好的情況下進(jìn)行,。

4.細(xì)胞培養(yǎng)全程應(yīng)注意無(wú)菌操作，用到的試劑耗材均使用75%酒精消毒,，同時(shí)也要對(duì)手部進(jìn)行消毒,。

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