質(zhì)粒是我們?nèi)粘嶒炛斜容^常用的載體，其可以自主生長,，也能通過比較容易的方法進行大量擴增,，但往往單一的質(zhì)粒不能滿足實驗需求，需通過一系列方法進行質(zhì)粒重組,，我目前比較常用的方法也就是比較陳舊的酶切重組質(zhì)粒的方式,，簡易實驗過程如下圖：

在這個過程中，有幾個小Tips：

1.原載體的酶切位點由文獻,、載體說明書或者導師建議得來,，選擇正確的酶切位點是重組質(zhì)粒開始的第一步，常見的酶切體系如下：

上述體系適用于大多數(shù)酶切,，不是特別難切開的載體1μl內(nèi)切酶足夠,，酶切前計算好量，先加ddH2O,，最后加內(nèi)切酶,。

2.酶切完成后，需要跑瓊脂糖膠鑒定酶切效果,，配膠時注意選擇合適的膠濃度,，原則是分子量越大，膠濃度越小,。跑膠完成后紫外燈下一般會有兩段即為成功：載體和切下來的片段,，根據(jù)結(jié)果進行膠回收，注意切下來的片段不回收,，膠回收完成后測濃度備用。

3.插入片段根據(jù)自己的實驗選擇,，通常插入片段可以通過PCR而來,，或者是一段由三方公司合成的序列，在連接開始前也需要用同樣的兩個內(nèi)切酶切出缺口,。常見連接體系如下：

其中,，加入載體和插入片段的量由說明書得來，加樣前計算好量,，先加ddH2O,，最后加連接酶，由于連接體系較小,，一般使用pcr管進行,。

4、為確保連接的順利進行,，務必保證連接酶和連接酶緩沖液配套使用,，即使用同一廠家的，不能混用,。

測序的準確性對于后續(xù)慢病毒感染是非常重要的,，因此測序公司的選擇十分重要，尤其出現(xiàn)一些比較難測的結(jié)構(gòu)如shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)等,，測序技術(shù)不成熟的話會一直報重疊峰或者測不通的情況,。

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