非特異性擴增,，即進行 PCR 所擴增出來的條帶不是所要的,，引物與模板在非目的條帶處有錯配,，導致延伸產(chǎn)物不是目的條帶,。例如引物二聚體,，即引物在退火過程中產(chǎn)生了 hairpin 結構或其他二級結構,，或者引物在模板的某些位置非特異性地結合，也同樣會產(chǎn)生非特異性擴增,。PCR 產(chǎn)物都是通過引物延伸產(chǎn)生的,。當引物產(chǎn)生了二聚體或者非特異性擴增產(chǎn)物之后，引物本身就無法再延伸形成 PCR 產(chǎn)物了,，這樣的情況下,，非特異性擴增產(chǎn)物越是多，那目的產(chǎn)物就越是少,。如果在 qPCR 過程中,，就會在熔解曲線中形成雙峰。

消滅 PCR 非特異性擴增的方法：

１,、引物設計的過程中要用 Primer premier 5.0 來驗證一下二聚體,；

2,、引物合成后，先做一次梯度 PCR,，檢測最合適的退火溫度,，一般高退火溫度可以提高引物對模板的特異性從而降低引物二聚體；

3,、降低 Mg2+濃度,，鎂離子濃度高，會導致大量的非特異性擴增,，但是沒有鎂離子的話,，也會導致 Taq 酶的失活；

4,、降低 dNTP 濃度,，dNTP 也是非特異性擴增的一個罪魁禍首，降低它的濃度,，也能有效降低二聚體及其他非特異性擴增,；

5、降低引物濃度,，一般的 PCR 引物都是過量的,，降低了引物濃度自然也能降低引物之間形成二級結構的可能性；

6,、提高退火溫度,，這個道理很簡單，引物的退火溫度提高,，引物間的二級結構形成可能性就會降低,；

7、延長退火時間,，這個也可以減弱引物間結合的可能性,；

8、DMSO 及甜菜堿,，這些 PCR 促進劑,，主要是用于 CG 含量高的模板上，降低 DNA 的二級結構的產(chǎn)生,，但根據(jù)經(jīng)驗,，加入 DMSO 之后需要同時提高一點退火溫度來補平（qPCR 不太適用）；

9,、熱啟動法,，通過 95℃的高溫熱啟動，高溫解鏈,，使得引物間的二級結構破壞,，以此降低二聚體產(chǎn)生,。

深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技術實力,、壹流的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè),。總部設在廣東,，服務面向全國,。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售,、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司,，旨在為生命科學的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學,、細胞生物學、免疫學,、信號傳導和神經(jīng)科學等領域的產(chǎn)品供應線,，在各個領域內(nèi)向用戶提供世界前沿水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構,、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品,、技術支持與服務。

消滅 PCR 非特異性擴增的方法

會員登錄

收藏該商鋪

提示