葉綠體的分離與熒光觀察

時(shí)間：2023/1/29閱讀：1470

原理

組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心,，是分離細(xì)胞器的常用方法,。一個(gè)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀,、密度,、離心力及介質(zhì)黏度等。同一離心場(chǎng)中,，同一時(shí)間內(nèi),，密度和大小不同的顆粒沉降速率不同。依次增加離心力和離心時(shí)間,，就能使非均一的懸浮液中的顆粒按其大小,、密度先后分批沉降在離心管底部，從而可分批收集各種亞細(xì)胞成分。

材料與儀器

新鮮菠菜
氯化鈉
離心機(jī) 組織搗碎機(jī) 顯微鏡天平離心管紗布燒杯量筒滴管載玻片,、蓋玻片

步驟

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 選取新鮮的嫩菠菜葉,，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈,，稱30 g 于150 ml 0.35 mol/L NaCI溶液中，裝入組織搗碎機(jī),。

2. 利用組織搗碎機(jī)低速（5 000 r/min）勻漿3~5 min,。

3. 將勻漿用6層紗布過(guò)濾于500 ml 燒杯中。

4. 取濾液4 ml 在1 000 r/min 下離心2 min,。棄去沉淀,。

5. 將上沾液在3 000 r/min下離心5 min。棄去上清液,，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞陔）,。

6. 將沉淀用0.35 mol/L NaCI溶液懸浮。

7. 取葉綠體懸液一消滴于載片上,，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察,。

（1）在普通光鏡下觀察。

（2）在熒光顯微鏡下觀察,。

（3）取葉綠體懸液一滴滴在無(wú)熒光載片上,，再漓加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，加無(wú)熒光蓋片后即可以熒光顯微鏡下觀察,。

菠菜葉手切片觀察用剖須刀將新鮮的嫩菠菜切削一斜面置于載片上,，滴加1~2滴0.35 mol/L NaCI溶液，加蓋片后輕壓,，置顯微鏡下觀察,。

（1）在普通光鏡下觀察。

（2）在熒光顯微鏡下觀察,。

（3）用同樣方法制片,，但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色1 min，洗去余液,，加蓋廾后即町以熒光顯微鏡下觀察,。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 葉綠體的分離和觀察

（1）普通光鏡下,，可看到葉綠體為綠色橄欖形,，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒,。

（2）以O(shè)lympus熒光顯微鏡為例,，在選用B(blue)激發(fā)濾片，B雙色鏡和O530（orange）阻斷濾片的條件下,，葉綠體發(fā)出火紅色熒光,。

（3）加入吖啶橙染色后,，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒色,。

2. 菠菜葉手切片觀察

（1）在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞

①表面細(xì)胞：為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細(xì)胞,。

②保衛(wèi)細(xì)胞：為構(gòu)成氣孔的成對(duì)存在的腎形細(xì)胞。

③葉肉細(xì)胞：為排成柵狀的長(zhǎng)方形和橢幽形細(xì)胞,。

葉綠體呈綠色橄欖形,，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。

（2）在熒光顯微鏡下,，葉綠體發(fā)出火紅色熒光,，但其熒光強(qiáng)度要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光,，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈,。表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。

（3）用吖啶橙染色后,，葉綠體則發(fā)出枯紅色熒光,，細(xì)胞核町發(fā)出綠色熒光，氣孔仍為綠色,。

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