一氧化氮合酶組化顯示法

時(shí)間：2023/1/13閱讀：1147

簡(jiǎn)介

細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase,，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸,。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶,，可以將孵育液中的底物脫氫,，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT），使后者還原成藍(lán)黑色沉淀,。

原理

一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本原理是細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase,，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶,，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT）,，使后者還原成藍(lán)黑色沉淀,，此即 NADPH 所在部位，也可代表 NOS 的所在部位,。

材料與儀器

器材：

染色缸,、載玻片、蓋片,、24孔板,、毛筆、解剖器材,、灌注器材,、冰凍切片機(jī),、濕盒、恒溫箱,、冰箱,、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠,。

試劑：

①孵育液（NADPH,、NBT）

（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），3 mg ,；硝基四氮唑藍(lán)(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL ）;

②0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（PB）

（磷酸二氫鈉（NaH2PO4•2H2O）,，3 g ；磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O）,，29 g ,；加少量蒸餾水，調(diào) pH 7.2～7.4,，最后定容至1000 mL ）;

③1％Triton X-100,。

④3％Triton X-100

⑤1％中性紅

⑥梯度乙醇

⑦0.01 mol ／ L PBS

⑧4％多聚甲醛

⑨中性樹(shù)膠

步驟

一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本過(guò)程可分為如下幾步：

（一）腦組織冰凍切片

A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊,，浸30％蔗糖后行冰凍切片（片厚40 μm ）,。

B．將切片浸入0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（0.1 mol ／ L PB，pH 7.2～7.4）中漂洗10 min ,，重復(fù)3 次 ,。

C．1％Triton X-100（用0.1 mol ／ L PB配制，pH7.4）中,，室溫,，預(yù)浸60 min 。

D．浸入孵育液中孵育,，37 ℃ ,，3 h 。

E．3％Triton X-100,4 ℃ ,，過(guò)夜,。

F．0.1 mol ／ L PB中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 ,。

G．裱片,，風(fēng)干。中性紅復(fù)染,。

H．常規(guī)脫水,、透明、封片、觀察,。

（二）細(xì)胞爬片或甩片

A．細(xì)胞爬片或甩片,，0.01 mol ／L PBS漂洗5 min ，重復(fù)3 次 ,。

B．4％多聚甲醛固定,，室溫，30 min ,。

C．0.01 mol ／ L PBS漂洗10 min ,，重復(fù)3 次。

D．按上述腦組織冰凍切片步驟（3）～（6）操作,。

E．中性紅復(fù)染,，常規(guī)脫水、透明,、封片,、觀察。

注意事項(xiàng)

1．冰凍切片采用的是漂浮法,，有利于孵育液充分進(jìn)入組織,。

2．本方法屬于酶組化，要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汉颓‘?dāng)?shù)墓潭〞r(shí)間和方法,，否則會(huì)影響酶的活性,。

3．此方法加 Triton X-100 可以改善著色效果，降低非特異性背景染色,。但 Triton X-100 預(yù)浸時(shí)間不能超過(guò)2 h ，孵育液中 Triton X-100 濃度不能高于2％,，否則影響著色效果,。孵育液中后加 Triton X-100 ，防止 NBT 難溶,。

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一氧化氮合酶組化顯示法

（一）腦組織冰凍切片

（二）細(xì)胞爬片或甩片

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