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Feulgen反應顯示細胞中DNA

時間：2023/1/13閱讀：2205
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簡介

Feulgen反應由Feulgen在1924年發(fā)明,，是一種傳統(tǒng)的,、也是最為經(jīng)典的通過化學染色來特異性顯示細胞中DNA的方法。

原理

Feulgen反應顯示細胞中DNA的基本原理是首先采用稀酸作用于DNA,，使其脫去嘌呤堿,，暴露出游離醛基，該醛基與Schiff試劑反應生成紫紅色產(chǎn)物,，細胞中存在有DNA的部位即呈現(xiàn)紫紅色陽性反應,。如圖3-1中所示，堿性品紅是紅色物質,，能與產(chǎn)生SO2的試劑作用形成無色產(chǎn)物,，即Schiff試劑，它可以與DNA水解釋放出的醛基結合而氧化為紫紅色化合物,。

用途

Feulgen 反應顯示細胞中 DNA 既可檢測細胞或組織中 DNA 的存在部位及分布,，也可利用其顯色強度與 DNA 含量成正比的特性，用于對細胞或組織中的 DNA 含量進行測定,。由于反應對含有 DNA 的核結構顯示細致,、清晰，染色穩(wěn)定,，有利于鑒別不同核結構和分化程度的細胞,，如白血病細胞等。

材料與儀器

器材：

尖頭鑷子,、染色缸,、蓋片、載玻片,、吸管,、吸水濾紙、普通光學顯微鏡,、恒溫水浴箱,、CO2培養(yǎng)箱、HeLa人宮頸癌上皮細胞,。

試劑：
①Hanks液


（1）原液甲NaCl 160 g ,，KC18 g ，MgSO4•7H2O2 g ,；MgCl2•6H2O2 g ,，溶于800 mL  蒸餾水中。CaCl2（無水）2.8 g ,，溶于100 mL 蒸餾水中,。將兩種液體混合后,，加水至1000 mL ，用濾紙濾過,，再加2 mL 氯仿防腐,，置4 ℃ 冰箱備用。

（2）原液乙 Na2HPO4•12H2O3.04 g ,，KH2PO41.2 g ,，葡萄糖20.0 g ，溶于800 mL 蒸餾水中,，用濾紙過濾，然后加0.5％酚紅80 mL ,，再加水至1000 mL ,，最后加入2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱備用,。
（3）使用液甲乙兩液各1 份 ,，雙蒸水18 份 ，混勻分裝,，經(jīng)101 bf ／in （68.9 kPa ）15 min 高壓滅菌后置4 ℃ 冰箱中保存,。臨用前用無菌的5.6％NaHCO3 調(diào)至所需 pH 值。）
②1 mol ／L 鹽酸
③Schiff 試劑
（堿性品紅0.5 g 加入100 mL 煮沸的蒸餾水中,，持續(xù)煮沸5 min ,，并隨時攪拌，使之充分溶解,。然后將其冷卻到50 ℃ ,，過濾到棕色瓶中，加1 mol ／L  HC110 mL ,，冷卻至25 ℃ 時加入1 g 無水亞硫酸氫鈉（NaHSO3）,，需充分振蕩后，避光過夜,。次日取出（呈淡黃色）,，加0.25 g 活性炭劇烈振蕩1 min ，過濾后即得 Schiff 試劑,，此時溶液應完-全無色,。避光、低溫,、密封保存,。用前應事先取出使其恢復至室溫。）
④ Carnoy 固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）
⑤0.5％亮綠
⑥蒸餾水
⑦70％乙醇
⑧80％乙醇

⑨95％乙醇


⑩無水乙醇
?二甲苯
?中性樹膠

步驟

Feulgen 反應顯示細胞中 DNA 的基本過程可分為如下幾步：
A.將培養(yǎng)的 HeLa 細胞接種于蓋片,，24～48 h 后生長為單層,。
B.取細胞蓋片1 張 ,，用 Hanks 液（pH 7.2～7.4）漂洗3 次 ，吸水濾紙吸干液體,。
C.放入 Carnoy 固定液中固定30 min ,。
D.蒸餾水洗3 次 。
E.將蓋片置于1 mol ／L 鹽酸中,，60 ℃ 水浴水解10 min ,。
F.蒸餾水洗1 次 。
G.將蓋片移入 Schiff 試劑中,，暗處反應30 min ,。
H.流水沖洗5 min 。
I.蒸餾水洗3 次 ,。
J.0.5％亮綠復染1～3 min ,。
K.70％乙醇→80％乙醇→95％乙醇→無水乙醇梯度脫水。
L.蓋片浸入二甲苯中透明5 min ,。
M.滴1 滴 中性樹膠于載玻片上,，將蓋片細胞面朝下封片。
N.鏡下觀察,。

注意事項

1.本實驗的關鍵步驟是有效地控制DNA水解的程度,，包括稀酸的濃度，水解的時間,、溫度等,。水解不足，會使游離醛基的暴露不完-全,，反應變?nèi)?；水解過度，會導致 DNA 異常降解,，也同樣使反應變?nèi)?，染色深度下降，嚴重時出現(xiàn)陰性反應,。一般的水解時間應控制在10～15 min ,，同時應考慮不同標本材料的影響。
2. Schiff 試劑的質量也是影響實驗結果的重要因素,，試劑暴露于空氣中易被氧化而變成紅色,，使試劑失效。操作及保存中不宜過多暴露于空氣,，并應注意避光,。
3.本實驗采用蓋片培養(yǎng)細胞，因此在整個操作過程中，應注明蓋片的正反面,，防止破壞細胞面,，尤其在進行流水沖洗步驟時，應避免水流直接接觸細胞面,。


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