人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)

時間：2023/1/12閱讀：1076

簡介

胚胎干細(xì)胞是具有一種具有自我更新和全能分化能力的細(xì)胞,，能發(fā)育分化出成體所有的組織和器官,，是體外研究發(fā)育調(diào)控機(jī)制理想的模型,，也是用于人類疾病的干細(xì)胞治療和器官組織移植理-想的種子細(xì)胞,。建立新的人類胚胎干細(xì)胞系仍然有很大的倫理學(xué)爭議,，目前對人胚胎干細(xì)胞的研究主要就是基于已經(jīng)建立的人胚胎干細(xì)胞系的研究,。

原理

人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)的原理是人胚胎干細(xì)胞快速生長和擴(kuò)增,，而細(xì)胞培養(yǎng)箱恰恰能提供培養(yǎng)所需的環(huán)境。

用途

胚胎干細(xì)胞常用于發(fā)育分化出成體所有的組織和器官,，是體外研究發(fā)育調(diào)控機(jī)制理想的模型,，也是用于人類疾病的干細(xì)胞治療和器官組織移植理-想的種子細(xì)胞。

材料與儀器

器材：

①37 ℃ 水浴鍋

②一次性無菌培養(yǎng)皿

③一次性無菌移液管

④T75培養(yǎng)瓶

⑤15 mL 離心管,、注射器和針頭

⑥涂有明膠的6 孔板

試劑：

①材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞

②95％乙醇

步驟

人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基本過程可分為如下幾步：

（一）試劑配制

（1）膠原酶溶液的配制使用濃度1 mg ／mL ,。膠原酶，30mg,；DF12培養(yǎng)基,，30 mL 。使膠原酶充分溶解于DF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基,。用0.22 μm 濾器過濾除菌,。

（2）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基的配制DF12培養(yǎng)基，200 mL ,；血清替代物50 mL ,；200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液，1.25 mL ,；非必需氨基酸100x溶液,，2.5 mL ；b-FGF 溶液,，5 mL ,。

所有組分都加入250ml培養(yǎng)瓶中，用0.22μm濾器過濾除菌,。培養(yǎng)基最好在2周內(nèi)使用,。

（3）200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液的配制200 mmol ／L -谷酰胺，5 mL ,；2-巰-基-乙-醇,，7 μl ，混勻,。

（4）b-FGF的配制b-FGF,，10 μg ；0.1％BSA無菌,，5 mL 溶解后按0.5 mL 每份分裝冷凍保存,。

（二）確定傳代時機(jī)

通常以下情況時,，胚胎干細(xì)胞需要傳代

①小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）飼養(yǎng)層超過2 周 ,。

②胚胎干細(xì)胞的克隆密度太高或克隆大小太大,。

③胚胎干細(xì)胞克隆出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

（三）膠原酶處理

（1）需要傳代時,，將胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出,，吸去培養(yǎng)上清。

（2）6 孔板培養(yǎng)時,，每個孔加1 mL 膠原酶溶液,。

（3）處理至少5 min 。

（4）倒置顯微鏡下觀察,，直至細(xì)胞克隆從培養(yǎng)板表面脫離,。注意：可以看到克隆周邊會出現(xiàn)皺褶。根據(jù)消化情況,，膠原酶處理時間可再延長6～10 min ,。

（四）刮細(xì)胞

（1）用5 mL 玻璃移液管，將細(xì)胞從培養(yǎng)板表面刮下來,。

（2）同時輕輕吹打膠原酶溶液,，使細(xì)胞從培養(yǎng)板上面完-全脫離。

（3）所有細(xì)胞團(tuán)都留在培養(yǎng)板中,，直到整個6 孔板都按步驟（1）,、（2）處理完。

注意：這些步驟可以直視下完成,，也可以在解剖纖維鏡下完成,。

（五）收集并打散克隆

（1）將整塊6 孔板的細(xì)胞都轉(zhuǎn)移到一個15 mL 離心管中。

（2）每個孔加1 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗,，并將沖洗液也轉(zhuǎn)移到細(xì)胞懸液中,。

（3）在15 mL 離心管中，輕輕吹打細(xì)胞懸液數(shù)分鐘,，進(jìn)一步打散細(xì)胞克隆,。注意：吹打時避免產(chǎn)生氣泡。

（六）離心傳代

（1）將打散的細(xì)胞克隆,，200 g 離心5 min ,。

（2）去除上清液。

（3）輕輕拍散細(xì)胞團(tuán),，加2～3 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，輕輕混勻。

（4）200 g 離心5 min 。

（5）胚胎干細(xì)胞離心同時,，將提前準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層培養(yǎng)板取出,，吸棄MEF培養(yǎng)基,。

（6）用6 孔板培養(yǎng)的飼養(yǎng)層,，每個孔加1 mL PBS，輕輕晃動,，洗去培養(yǎng)基中所含的血清,。

注意：PBS處理成纖維細(xì)胞的時間不要超過6～10 min 。

（7）胚胎干細(xì)胞離心結(jié)束后,，棄去上清液,，輕輕拍散細(xì)胞團(tuán)。

（8）加入2～3 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基,，重懸細(xì)胞,。

（9）再加入足夠的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，使6 孔板的每個孔細(xì)胞懸液體積為2.5 mL ,。

（10）去除飼養(yǎng)層培養(yǎng)板中的PBS,，每個孔加入2.5 mL 細(xì)胞懸液，用移液管輕輕混勻,。

（11）在水平臺面上,，短促地上下左右地晃動培養(yǎng)板，使加入的胚胎干細(xì)胞均勻分布到飼養(yǎng)層上,。

（12）將培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞放入培養(yǎng)箱,，使克隆重新貼壁。注意：在重新貼壁的這段時間內(nèi),，要盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱,，維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，以利于胚胎干細(xì)胞重新貼壁,。

（13）每天更換新鮮培養(yǎng)基,。注意觀察克隆生長狀態(tài)，在需要時按上述步驟再次傳代,。

（七）凍存

（1）按上述步驟收集胚胎干細(xì)胞細(xì)胞懸液,，200 g 離心5 min 。

（2）配好的凍存液（90％胎牛血清,，10％DMSO）置于冰上備用,。

（3）棄去上清液，將細(xì)胞團(tuán)排松散后用凍存液重懸,，逐滴加入凍存液,，混勻。一般一個6 孔培養(yǎng)板凍6 支 ,，重懸時每個培養(yǎng)板的細(xì)胞加6 mL 凍存液,。

（4）迅速將1 mL 細(xì)胞懸液裝入1.5 mL 凍存管,。蓋緊后放入異丙醇凍存盒中。

（5）將凍存盒降至室溫后,，轉(zhuǎn)入-80 ℃ 冰箱,，保存過夜。

（6）次日將凍存的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐保存,。

注意：人胚胎干細(xì)胞凍存前不能將細(xì)胞消化成單細(xì)胞,，消化后的細(xì)胞團(tuán)塊稍大為好。

（八）復(fù)蘇

（1）將凍存的胚胎干細(xì)胞從液氮中取出,，浸入37 ℃ 水浴,，輕輕轉(zhuǎn)動，注意凍存管蓋不要沒入水中,。

（2）當(dāng)只剩一個小冰晶時,，將凍存管從水浴中取出。

（3）將凍存管浸入95％乙醇浴消毒,，在無菌超凈臺中晾干,。

（4）將細(xì)胞從凍存管中轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，逐滴加入4 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基,，輕輕混勻,。

（5）200 g 離心5 min ，去除凍存液,。

（6）去除上清液,，將細(xì)胞團(tuán)輕輕拍散，加2.5 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。

（7）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到鋪有照射后的飼養(yǎng)層細(xì)胞的6 孔板中,。每孔加2.5 mL 細(xì)胞懸液。飼養(yǎng)層細(xì)胞提前用1 mL PBS洗一遍,，去除血清,。

（8）放入培養(yǎng)箱，第二天將細(xì)胞上面漂浮的死細(xì)胞吸去并換液,，按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng),。

（9）每天觀察細(xì)胞密度。按需傳代,。

注意事項(xiàng)

（1）所有試劑都應(yīng)記錄保質(zhì)期和批號,，小包裝分裝保存，避免反復(fù)凍存,。培養(yǎng)基配制后最好在2 周內(nèi)用完,。

（2）胚胎干細(xì)胞克隆的消化液可有多種選擇，除了上文介紹的膠原酶消化，也可用0.05％的胰蛋白酶消化,，消化時間比膠原酶消化所需時間要短,，一般1～2 min ，待克隆周邊有皺褶時,，要加用MEF培養(yǎng)基中止胰蛋白酶作用,，其他步驟基本一致。

（3）用消化傳代的時候務(wù)必不能將人胚胎干細(xì)胞消化成單個細(xì)胞,，否則克隆形成率很低,。

（4）傳代時細(xì)胞密度很重要，人胚胎干細(xì)胞一般的傳代比例是1:5～1:10,。接種的細(xì)胞太少不易生長，最好4～6 d 傳代一次,。

（5）人胚胎干細(xì)胞對營養(yǎng)要求很高,，因此必須每天換液，細(xì)胞一般培養(yǎng)在6 孔皿中,。

（6）一般使用第2～4 代的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞,。細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿后一般在3 d 內(nèi)使用，放置時間過長的飼養(yǎng)層細(xì)胞不利于人胚胎干細(xì)胞生長,。

（7）人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境是37 ℃ ,，飽和濕度，5％CO2,。培養(yǎng)箱應(yīng)當(dāng)每月清洗和衡一次,，最好不要在同一培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)其他種類的細(xì)胞，以免交叉污染,。

以上就是本期的內(nèi)容,，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊,。

安培生物科技有限公司介紹：

安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究,、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn),、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶,，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn),，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等,，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化,、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品,；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品,。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè),。

人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)

（四）刮細(xì)胞

（五）收集并打散克隆

（六）離心傳代

（七）凍存

會員登錄

收藏該商鋪

提示