材料與儀器

步驟

1a) 收集轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細胞：將 5× 108?10× 108 細胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 離心 20 min,。輕輕倒去上清并丟棄,，將細胞轉(zhuǎn)入50 mL 錐形刻度離心管中（每管 2?3 L 培養(yǎng)液中的細胞）,。進行步驟 2,。

1b) 收集單層培養(yǎng)的細胞：單層細胞長滿后去掉培養(yǎng)液,。用足量 PBS 洗 1 次，PBS 用 量為沒過細胞,，輕輕振蕩,，棄 PBS,。將細胞刮入新鮮 PBS 液里，倒進錐形刻度離心管中,。進行步驟 2,。

2) 1850 g 離心 10 min。進行步驟 3a 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或步驟 3b 單層培養(yǎng),。

3a) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞：輕輕倒出上清并棄掉,。用離心管上的刻度測量壓緊后細胞的體積 (Pcv)將細胞重懸于約 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 離心10 min,。進行步 驟 4,。

3b) 單層培養(yǎng)細胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量 pcv, 進行步驟 4,。

4) 快速地將沉淀的細胞重懸于 5 倍體積的低滲緩沖液中1850 g 離心 10 min 并棄掉上 清,。

5) 將細胞沉淀重懸于 3 倍于原 pcv 的低滲緩沖液中，放置在冰上 10 min,，讓細胞腫脹,。

6) 將細胞轉(zhuǎn)到 Dmmce 氏玻璃勻漿器中，用 B 號研杵上下抽提 10 次,。用臺盼藍染色排斥法在顯微鏡下檢査細胞裂解情況（應(yīng)大于80%?90%),。

7) 將細胞轉(zhuǎn)到離心管中。用 JS4.2 轉(zhuǎn)子 3300 g 離心 15 min 收集細胞核,。保留上清用來制備 S-l00 細胞質(zhì)提取物,。

8) 用離心管上的刻度測量第 7 步離心壓緊后的細胞核體積（pnv)。用 l/2 pnv 體積的低鹽緩沖液重懸細胞核,。

9) 在輕輕攪拌的同時,，逐滴加入1/2 pnv 體積（見步驟 8) 的高鹽緩沖液。必要時用 Dounce 氏玻璃勻裝器混勻,。

10) 不斷輕輕攪拌 30 min 以提取核內(nèi)容物,。

11) 用 Beckman JA-20 轉(zhuǎn)子 25 000 g 離心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并測量其電導(dǎo)率（見步驟 12),，這就是核提取物,。

12) 將核提取物加入透析管中，用夾子至少封住透析袋的一端,；透析袋一端是打開的,， 這樣就可以測量透析袋內(nèi)核提取物的電導(dǎo)率，比較核提取物電導(dǎo)率和透析液電導(dǎo)率 的不同,，以確定是否需要進一步透析,。在 50 倍體積的透析液中進行透析，直到提 取物的電導(dǎo)率和透析液一致為止（即提取物的 KCr 濃度達到 100 mmol/L 時）,。盡量縮短透析時間,。

取 5?10 μl 提取物用水稀釋至 1 mL 用來測電導(dǎo),。用電導(dǎo)測量儀直接讀出稀釋液的電導(dǎo)值，與同樣稀釋的透析液的電導(dǎo)值相比較,。

13) 將提取物從透析袋中移出,，最后一次檢測其電導(dǎo)率以確定透析已經(jīng)完成,。將提取物25000 g 離心 20 min, 棄掉沉淀,。

14) 測定上清中蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)需要分裝,，浸入液氮中速凍,，-80℃保存。

注意事項