傳統(tǒng)上的細(xì)胞凍存（甘油/二甲基亞砜做保護(hù)劑）講求的是：慢凍速溶,。細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入的甘油或二甲基亞砜（DMSO）,，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

用途

細(xì)胞保種

材料與儀器

【實驗材料】細(xì)胞,、DMSO,、0.25% Trypsin-EDTA（或細(xì)胞刮刀）、100 X雙抗,、PBS,、胎牛血清、DMEM 完-全培養(yǎng)基,、75% 乙醇,、胰酶、異丙醇,；

【儀器與用品】凍存管,、37度恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿（6 cm）,、細(xì)胞凍存盒（已添加異丙醇）或凍存泡沫盒,、記號筆、-80度冰箱,、倒置相差顯微鏡,、凍存管、37度恒溫水浴鍋,、培養(yǎng)皿（6cm）、液氮罐,、離心機(jī),、細(xì)胞房專用超凈臺、移液槍及移液槍頭（無菌或滅菌后烘干）,、一次性細(xì)胞計數(shù)板,、細(xì)胞自動計數(shù)儀、培養(yǎng)箱,、移液管,。

步驟

1. 預(yù)先配制凍存液：按正常培養(yǎng)基：DMSO =9:1比列配制凍存液;

2. 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來,，離心1000 rpm,，5 min;

3. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,，計數(shù),，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/mL～1×107/mL;

4. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml;

5. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,，凍存時間,、細(xì)胞代數(shù)及操作者;

6. 往凍存盒中加入異丙醇（在負(fù)八十冰箱中能以1℃/min的速度下降）放入負(fù)八十冰箱即可，建議12小時以上,，一般可在負(fù)八十中保存半年至一年,，長期保存要轉(zhuǎn)移至液氮中；商用凍存液可以直接凍存管放負(fù)八十冰箱,。

注意事項

1,、液氮凍存不建議用國產(chǎn)凍存管，復(fù)蘇時容易爆管,；

2,、消化細(xì)胞時，不能過度消化,；

3,、DMSO溶于DMEM培養(yǎng)基會放熱，應(yīng)提前5-10分鐘配置凍存液,。用凍存盒時避免異丙醇將標(biāo)記擦掉,；

4、二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜,，包括皮膚和橡膠手套,。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎處理,。將凍存管放入液氮時,，必須使用保護(hù)性手套和面罩。

常見問題

1,、細(xì)胞消化過度,，導(dǎo)致復(fù)蘇時細(xì)胞狀態(tài)不好；

2,、負(fù)八十冰箱中長期保存細(xì)胞效果不好,，應(yīng)及時將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中；

3,、國產(chǎn)凍存管在液氮中容易漏液氮,，導(dǎo)致復(fù)蘇時曝管，所以放液氮中盡量使用質(zhì)量較好的凍存管,。

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細(xì)胞凍存實驗

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